| 货号：UPLC-MS-4549 | 规格：100T/48S | 微量法 |
| 货号：UPLC-MS-4548 | 规格：50T/24S | 可见分光光度法 |
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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提取液 |
液体 60 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂一 |
液体 20 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂二 |
液体 1 mL×1 支 |
2-8℃保存 |
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标准品 |
粉剂×1 支 |
2-8℃保存 |
溶液的配制：
标准品：10 mg 还原型谷胱甘肽（GSH）。临用前加入 1.3 mL 蒸馏水，配制成 25 µmol/mL，2-8℃保存两周。
生物体内巯基主要包括谷胱甘肽巯基和蛋白质巯基。前者不仅能够修复氧化损伤的蛋白质，而且参与活性氧清除，后者对于维持蛋白质构象具有重要作用。通过测定总巯基含量和GSH含量，能够间接测定蛋白质巯基含量。
巯基基团与5,5’-二硫代-双-硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色化合物，在412nm处有最大吸收峰。
最低检出限：0.0088 μmol/mL
线性范围：0.015625-1 μmol/mL
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、台式离心机、恒温水浴锅、研钵/匀浆器和蒸馏水。
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 动物、植物组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（称取称取约 0.1g 组织，加入 1mL的提取液），冰浴匀浆，8000g，常温离心 10min，取上清待测。
2. 血清，培养液：直接测定。若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定。
二、测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，分光光度计蒸馏水调零。
2、标准液的稀释：将25μmol/mL标准溶液用蒸馏水稀释至0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625μmol/mL的标准液，现用现配。
3、 标准液稀释可参考下表：
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序号 |
稀释前浓度（µmol/mL） |
标准液体积（µL） |
蒸馏水体积（µL） |
稀释后浓度（µmol/mL） |
|
1 |
25 |
20 |
980 |
0.5 |
|
2 |
0.5 |
200 |
200 |
0.25 |
|
3 |
0.25 |
200 |
200 |
0.125 |
|
4 |
0.125 |
200 |
200 |
0.0625 |
|
5 |
0.0625 |
200 |
200 |
0.03125 |
|
6 |
0.03125 |
200 |
200 |
0.015625 |
备注：实验中每个标准管需 40µL 标准溶液。
4、 操作表
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试剂名称 |
对照管 |
测定管 |
标准管 |
空白管 |
|
样本（μL） |
40 |
40 |
- |
- |
|
标准品（μL） |
- |
- |
40 |
- |
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试剂一（μL） |
150 |
150 |
150 |
150 |
|
试剂二（μL） |
- |
10 |
10 |
- |
|
H2O（μL） |
10 |
- |
- |
50 |
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混匀，室温准确静置10min，测定412nm吸光值，分别记为A对照、A测定、A标准、A空白，并计算ΔA 标准= A标准-A空白、ΔA测定= A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需测1-2 次。 |
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1、标准曲线的绘制：根据标准管的浓度（y，µmol/mL）和吸光度ΔA标准（x，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（x，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（y，μmol/mL）。
2、总巯基含量计算：
（1） 按样本质量计算：总巯基含量（μmol/g 质量）=y×V样总÷W=x÷W
（2） 按样本蛋白浓度计算：总巯基含量（μmol/mg prot）=y×V样总÷（Cpr×V样总）=y÷Cpr
（3） 按血清、培养液体积计算：总巯基含量（μmol/L）=y×V样÷（V样×10-3）=1000y
V样总：加入提取液体积，1mL；V样：加入的样本体积，0.04mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度， mg/mL；10-3：单位换算系数，1mL=10-3L。
如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。注意同步修改计算公式。
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