货号:UPLC-MS-4553 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4552 | 规格:50T/48S |
可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 100 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
试剂一 |
液体 15 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
试剂二 |
液体 6 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
试剂三 |
液体 2 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
标准品 |
粉剂×1 支 |
2-8℃保存 |
溶液的配制:
1、 提取液:使用前置于 2-8℃冰箱或冰上预冷;
2、 标准品:10 mg FeSO4·7H2O。临用前加入 0.9 mL 蒸馏水,20μL 浓硫酸,配制成 40 µmol/mL FeSO4 标准溶液备用;
3、 混合液:将试剂一、试剂二、试剂三按 7:1:1 的比例混合,现配现用,用多少配多少。使用前置于 37℃水浴锅或 37℃恒温培养箱中预热 10min。
测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。在生物学、医学和药学研究中常常检测血浆、血清、唾液、尿液等各种体液,细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液及各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总 抗氧化能力。在酸性环境下,还原 Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的 Fe2+-TPTZ 的能力反映了总抗氧化能力。
技术指标:
最低检出限:0.000567243 μmol/mL
线性范围:0.00078125-0.1 μmol/mL
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、恒温水浴锅、低温离心机、细胞超声破碎仪、研钵/匀浆器、浓硫酸、冰和蒸馏水。
1、血清、血浆、唾液或尿液样本
血浆(制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝,不宜使用 EDTA 抗凝)5000r/min 离心 10min,取上清待测。血清、唾液或尿液样本直接用于测定,也可以-80℃冻存(不宜超过 30d)后再测定。
2、细胞或细菌样本收集细胞或细菌于离心管中。按照细胞或细菌数量(104):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例,加入1.0mL 预冷的提取液(建议取 500 万细胞,加入 1mL 预冷的提取液),超声破碎细胞(功率 200W,超声开 3s,关9s,总时间 3min),然后 10000rpm,4℃离心 10min,取上清置于冰上待测。
3、组织样本
按照组织质量(g)︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 预冷的提取液) 进行冰浴匀浆,然后 10000rpm,4℃离心 10min,取上清置于冰上待测。
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 593nm,分光光度计用蒸馏水调零。
2、标准溶液的制备:将 40 µmol/mL 标准溶液用蒸馏水稀释为 0.15、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.00156μmol/mL 标准溶液备用。
3、标准液稀释可参考附表:实验中每个标准管需 100µL 标准溶液。
4、吸取 100μL 标准溶液(蒸馏水作空白)加入 100μL 试剂二,充分混匀,反应 10min,测定 593nm 下的吸光度, 计算ΔA 标准=A 标准-A 空白,此时 Fe2+终浓度为 0.075、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.00156、0.00078μmol/mL,标准曲线只需做 1-2 次。
三、总抗氧化能力计算公式
1、 标准曲线绘制
根据 Fe2+终浓度(x,μmol/mL)和吸光度ΔA 标准(y,ΔA 标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA 测定(y,ΔA 测定)带入公式计算样本浓度(x,μmol/mL)。
2、计算公式:
单位定义:样本的抗氧化能力以达到同样吸光度变化值(ΔA)所需的标准液离子浓度(μmol/mL)表示。
(1) 按蛋白浓度计算
总抗氧化能力(μmol/mg prot)=x×V反总÷(V样× Cpr)=34×x÷Cpr
(2) 按样本质量计算
总抗氧化能力(μmol/g 质量)=x×V反总÷(V样÷V样总×W)=34×x÷W
(3) 按细胞数量计算
总抗氧化能力(μmol/104 cell)=x×V反总÷V样×V样总÷细胞数量=34×x÷细胞数量
(4) 按液体体积计算
总抗氧化能力(μmol/mL)=x×V反总÷V样 =34×x
V 样总:加入提取液体积,1mL;V 反总:反应总体积,0.204mL;V 样:反应中样本体积,0.006mL;W: 样本质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;细胞数量:以 104 为单位,以万计。
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