硝酸还原酶(NR)活性检测试剂盒-硝酸还原酶(NR)试剂盒-上海液质



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货号:UPLC-MS-4517 规格:50T/48S 紫外分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

诱导剂储备液

液体 50 mL×1

4℃保存

提取液

液体 80 mL×1

4℃保存

试剂一

液体 30 mL×1

-20℃保存

试剂二

粉剂×1

-20℃保存

溶液的配制:

1 诱导剂储备液:用蒸馏水 10 倍稀释后使用,即取 10mL 诱导剂储备液加 90mL 蒸馏水,充分混匀,现配现用。

2 试剂二:临用前加入 5 mL 提取液溶解,可分装后-20℃保存,避免反复冻融,-20℃可保存 2 周。

产品说明:

NR(EC 1.7.1.3)广泛存在于植物中,是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶,也是诱导酶,对作物的产量和品质有影响。

NR 催化硝酸盐还原为亚硝酸盐,NO3ˉ +NADH+H→ NO2ˉ +NAD+H2O,NADH 340nm 下有特征吸收峰, 340nm 下吸光值的变化即可表示酶活。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、1mL 石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、取适量诱导剂于烧杯中,将新鲜标本洗净,滤纸吸干,放入诱导剂应用液中(淹没即可)避光,浸泡 2h,取出样本,滤纸吸干后,-20℃冷冻 30min,取出样本,滤纸吸干。(一般不需要诱导处理,预实验结果没有活性则需要进行诱导处理)

2、称取约 0.1 g 样本,加入 1 mL 提取液,冰浴研磨,4000g,4℃离心 10 min,取上清置冰上待测。

二、测定步骤

1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、样本测定(在 EP 管中加入下列试剂)


试剂名称(μL

测定管

空白管

样本

60

-

提取液

340

400

试剂一

540

540

试剂二

60

60

充分混匀后测定 340nm 下的初始值 A1,25℃(其他物种) 37℃(哺乳动物)反应 30min 后再次测定吸光 A2,计算 ΔA 测定管=A1 测定管-A2 测定管,ΔA 空白管= A1 空白管-A2 空白管,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。(空白管只需测 1-2 次)

三、NR 活性计算

          (1) 按样本质量计算:

酶活单位定义:每小时每 g 样本中消耗 1μmol NADH 的量为一个 NR 活力单位。

NR(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(W÷V 提取×V 样) ÷T=5.359×ΔA÷W

(2) 按样本蛋白浓度计算:

酶活单位定义:每小时每 mg 组织蛋白消耗 1μmol NADH 的量为一个 NR 活力单位。NR(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样×Cpr) ÷T=5.359×ΔA÷Cpr

V 反总:反应体系体积,0.001L;V 样:吸取样本体积,0.06mL;V 提取:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,0.5h;ε:NADH 的摩尔消光系数,6220L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W 样本质量,g;106:单位换算系数,1mol=106 μmol。

注意事项:

1 当测定的吸光值大于 1.5 或者 ΔA 大于 0.6 时,建议将上清液稀释后测定。

2 ΔA 测定过小(小于 0.01),可延长酶促反应时间。

3 建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。

4 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,空白管的初始测定值(A1 空白管) 0.9 左右,变化不超过 0.05。


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