硝酸还原酶(NR)活性检测试剂盒(Griess 显色法)--硝酸还原酶(NR)试剂盒(Griess 显色法)-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-6034 规格:100T/48S 微量法
货号:UPLC-MS-6033 规格:50T/24S 可见分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

诱导剂储备液

液体 50 mL×1

4℃保存

提取液

液体 30mL×1

4℃保存

试剂一

液体 12 mL×1

-20℃保存

试剂二

粉剂×2

-20℃保存

试剂三

液体 15 mL×1

4℃保存

试剂四

液体 15 mL×1

4℃保存

标准品

液体 1 mL×1

4℃保存

溶液的配制:

1 诱导液:将诱导剂储备液用蒸馏水 10 倍稀释后使用,即取 10 mL 诱导剂储备液加 90 mL 蒸馏水,充分混匀。现配现用。

2 试剂二:加入 1mL 蒸馏水,-20℃分装保存,可以-20℃保存 2 周。临用前用蒸馏水将试剂二稀释 50 倍, 备用,即取 10 μL 试剂二加入 490 μL 蒸馏水混匀。

3 标准品:10 μmol/mL 亚硝酸钠标准溶液。临用前将用蒸馏水标准溶液稀释 100 倍得到 0.1 μmol/mL 的亚硝酸钠标准液,备用。

产品说明:

NR(EC 1.7.1.3)广泛存在于植物中,是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶,也是诱导酶,对作物的产量和品质有影响。NR 催化硝酸盐还原为亚硝酸盐,NO3ˉ +NADH+H→NO2ˉ+NAD+H2O。在酸性条件下,产生的 NO2ˉ能够参与重氮化反应生成紫红色化合物,这种紫红色化合物在 540 nm 处有吸收峰,540 nm 下吸光值的变化即可表示酶活。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、水浴锅/培养箱、台式离心机、1 mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

 

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、组织前处理:

(1) 取适量诱导液于烧杯中,将新鲜标本洗净,滤纸吸干,放入诱导液中(淹没即可),避光浸泡 2 h,取出样本, 滤纸吸干后,-20℃冷冻 30 min,取出样本,滤纸吸干。(根据需要进行诱导处理,一般不需要诱导处理,预实验 结果没有活性则需要进行诱导处理)

(2) 按照组织质量(g):提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(称取约 0.1 g 样本,加入 1 mL 提取液),冰浴研磨,8000g,4℃离心 10 min,取上清置冰上待测。

2、细胞或细菌的前处理:

先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

二、测定步骤

1 可见分光光度计预热30 min以上,调节波长至540 nm,蒸馏水调零。

2 样本测定:

试剂名称(μL

测定管

对照管

标准管

空白管

样本

100

100

-

-

0.1 μmol/mL标准溶液

-

-

100

-

蒸馏水

-

375

-

475

试剂一

375

-

375

-

试剂二

125

125

125

125

混匀,37℃(哺乳动物)25℃(其他物种)反应30 min

试剂三

250

250

250

250

试剂四

250

250

250

250

混匀,室温显色20 min后测定540nm下的吸光度,分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。

三、NR活性计算

           (1) 按样本蛋白浓度计算:

酶活定义:每小时每 mg 组织蛋白催化产生 1 μmol NO -的量为 1 NR 活力单位。

NR 活力(U/mg prot)= C 标准×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)×V 样本÷(V 样本×Cpr)÷T×F= 0.2×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷Cpr×F

(2) 按样本质量计算:

酶活定义:每小时每 mg 组织催化产生 1 μmol NO -的量为 1 NR 活力单位。

NR 活力(U/g 质量)=C 标准×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)×V 样本÷(W×V 样本÷V 提取)÷T×F= 0.2×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷W×F

(3) 按细胞数量计算:

酶活定义:每小时每 1 万个细胞或细菌催化产生 1 μmol NO2-的量为 1 NR 活力单位。NR 活力(U/104 cell)

=C 标准×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)×V 样本÷(细胞或细菌数量×V 样本÷V 提取)÷T×F

=0.2×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷细胞或细菌数量×F

C 标准:亚硝酸钠标准溶液浓度,0.1 μmol/mL;V 提取:加入提取液体积,1 mL;W:样本质量,g;T:反应时间,0.5 h;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;V 样本:加入的样本体积,0.1 mL;细胞或细菌数量:以万计;F 样本稀释倍数。

注意事项:

1. 吸光度大于 0.8 时,建议用提取液稀释样本,注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。

2. 严格按照样本测定表格列出顺序加入试剂进行实验。


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