上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-4329	规格：100T/48S	微量法
货号：UPLC-MS-4328	规格：50T/24S	可见分光光度法

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1、 提取液二：易挥发试剂，用完后盖紧盖儿后及时放回-20℃保存；

2、 试剂一：临用前加入 10 mL 试剂三，充分溶解待用；

3、 试剂二：临用前加入 10 mL 试剂三，充分溶解待用；

4、 试剂四：临用前加入 0.75 mL 双蒸水，充分溶解待用；

5、 工作液的配制：临用前根据用量将试剂一、试剂二按 1:1 比例混合，现配现用；

6、 标准品：10 mg α-酮戊二酸。临用前加入 684 μL 蒸馏水，配成 100 μmol/mL 标准液。

产品说明：

线粒体异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，ICDHm），广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，与线粒体基因表达及线粒体其他的功能有关。异柠檬酸脱氢酶在生物体内有两种存在形式，以NAD为辅酶的NAD-依赖型异柠檬酸脱氢酶，和以NADP为辅酶的NADP-依赖型异柠檬酸脱氢酶。

异柠檬酸脱氢酶的主要功能，是在体内三羧酸循环中，催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸，将NAD还原成NADH， 通过测定α-酮戊二酸的生成量，可以计算出线粒体异柠檬酸脱氢酶活力高低。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

低温离心机、可见分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1．称取约 0.3g 组织或收集 1500 万细胞，加入 1.5mL 提取液一和 15μL 提取液二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2．4℃，1000g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中，4℃，11000g 离心 15min。

3. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的异柠檬酸脱氢酶（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4. 在沉淀中加入 600μL 提取液三和 6μL 提取液二，超声波破碎（功率 40%，超声 5 秒，间隔 9 秒，4min），4℃，10000g 离心 10 min，取上清液用于线粒体异柠檬酸脱氢酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至505nm，蒸馏水调零。

2、 将标准品用提取液三稀释至0.6、0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875 μmol/mL标准溶液。

3、 操作表（在1.5 mLEP管中进行如下操作）：

三、ICDHm活性计算

1、标准曲线绘制：

以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA带入方程得到x(μmol/mL)。

2、酶活力计算：

酶活定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1 nmol α-酮戊二酸定义为一个酶活性单位。

ICDHm酶活力（U/mg prot）=x×V上清÷（Cpr×V上清）÷T×103=x÷Cpr×16.67

V上清：加入上清液体积，0.2mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，需自行测定；T：反应时间，1h=60min；103： 单位换算系数，1μmol =103nmol。

注意事项：

1、 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1），可用提取液三稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。

2、 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

3、 附：使用样本重量计算公式