上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-4592	规格：100T/48S	微量法
货号：UPLC-MS-4588	规格：50T/24S	可见分光光度法
货号：UPLC-MS-4588	规格：25T/12S	可见分光光度法

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

25T 溶液配制：

1. 试剂二：临用前每支加入 1.11 mL 双蒸水，充分溶解备用，分装后-20℃保存，避免反复冻融；

2. 试剂四：临用前加入 3 mL 双蒸水，充分混匀；

3. 试剂五：临用前加入 10 mL 双蒸水，充分混匀

4. 试剂六：临用前加入 10 mL 双蒸水，充分混匀；

5. 标准品：10 μmol/mL 磷标液，临用前用蒸馏水稀释 40 倍即 0.25 μmol/mL 磷标准液；

6. 定磷试剂的配制：按 H₂O：试剂五：试剂六：试剂七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。

50T 溶液配制：

1. 试剂二：临用前每支加入 1.11 mL 双蒸水，充分溶解备用，分装后-20℃保存，避免反复冻融；

2. 试剂四：临用前加入 6 mL 双蒸水，充分混匀；

3. 试剂五：临用前加入 20 mL 双蒸水，充分混匀；

4. 试剂六：临用前加入 20 mL 双蒸水，充分混匀；

5. 标准品：10 μmol/mL 磷标液，临用前用蒸馏水稀释 40 倍即 0.25 μmol/mL 磷标准液。

6. 定磷试剂的配制：按 H₂O：试剂五：试剂六：试剂七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

产品说明：

线粒体复合体Ⅴ又称 F₁F₀-ATP 合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由 F₁ 和 F₀ 两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化 ATP 合成，也可逆过程水解 ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成 ATP 的关键酶。复合体Ⅴ水解 ATP 产生 ADP 和 Pi，通过测定 Pi 增加速率来测定复合体Ⅴ活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

台式离心机、可见分光光度计、水浴锅、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1.0mL 提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2. 4 ℃ 600g 离心 10min。

3. 将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000g 离心 15min。

4. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

5. 在沉淀中加入 600μL 试剂一，超声波破碎（功率 20%，超声 5 秒，间隔 10 秒，重复 12 次），用于复合体Ⅴ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1. 分光光度计预热30min 以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。

2. 样本测定：

三、复合体Ⅴ活性计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。复合体Ⅴ活性（U/mg prot）=ΔA 测定÷ΔA 标准×C 标准×V 酶促×1000÷（Cpr×V 样本）÷T=20×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr

C 标准：标准溶液浓度，0.25μmol/mL；1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL， 需自行测定；V 样本：样本体积，0.05mL；V 酶促：酶促反应总体积，0.12mL；T：反应时间，30min。

注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取 1-2 个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于 1），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数

2. 由于提取液中含有蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量(单独测定)。

3. 测定胞浆时，定磷后反应液可能会有絮凝产生，测定前混合均匀即可，并不影响测定结果。

4. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

5. 本试剂盒试剂足够完成 100 管反应。6. 附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为 100T/24S）

A、上清中复合体Ⅴ活力的计算：

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟产生 1nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=ΔA1÷ΔA 标准×C 标准×V 酶促×1000÷(W÷V 提取×V 样本)）÷T=20×ΔA1÷ΔA 标准÷W

ΔA1：上清测定值；C 标准：标准溶液浓度，0.25μmol/mL；1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol；V 提取： 加入提取液体积，1.0mL；V 样本：样本体积，0.05mL；V 酶促：酶促反应总体积，0.12mL；T：反应时间，30min。

B、沉淀中复合体Ⅴ活力的计算：

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=ΔA2÷ΔA 标准×C 标准×V 酶促×1000÷(W÷V 提取×V 样本)）÷T=12×ΔA2÷ΔA 标准÷W

ΔA2：沉淀测定值；C 标准：标准溶液浓度，0.25μmol/mL；1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol；V 提取： 沉淀重悬体积，0.6mL；V 样本：样本体积，0.05mL；V 酶促：酶促反应总体积，0.12mL；T：反应时间，30min。

C、样本复合体Ⅴ总活力的计算：

样本复合体Ⅴ总活力即为上清中复合体Ⅴ活力与沉淀中复合体Ⅴ活力之和。

按样本质量计算：复合体Ⅴ（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA 标准÷W+12×ΔA2÷ΔA 标准÷W