上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-4586	规格：100T/48S	微量法
货号：UPLC-MS-4585	规格：25T/12S	可见分光光度法
货号：UPLC-MS-4585	规格：50T/24S	可见分光光度法

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

工作液的配制：临用前把试剂二转移到试剂一中混合溶解，用不完的试剂 4℃可保存一周；

产品说明：

线粒体复合体Ⅲ（EC 1.10.2.2）又称CoQ-细胞色素C还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责把还原型CoQ的氢传递给细胞色素C，生成还原型细胞色素C。

与氧化型细胞色素C不同，还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，因此550nm光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

实验中所需仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板（非聚苯乙烯材质）、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0 mL提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 4 ℃ 600 g离心10min。将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g离心15min。

3、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅲ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4、 在沉淀中加入200μL提取液，超声波破碎（功率20%，超声5秒，间隔10秒，重复15次），用于复合体Ⅲ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。

2、 操作表：在微量玻璃比色皿或96孔板中分别加入

三、复合体Ⅲ活力单位的计算

1、按微量玻璃比色皿计算： 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。复合体Ⅲ活力(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T=261×ΔA÷Cpr

V反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×104L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

2、按96孔板计算：

将上述公式中的d-1cm 改为d-0.6cm 进行计算即可。

注意事项：

1、 尽量保持比色皿内反应液温度在 37℃或 25℃。可以在记录初始吸光度 A1 后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴中准确反应 2 分钟，之后迅速取出比色皿并擦干，记录 2min 时的吸光度。

2、 当测定吸光值大于 1 时，建议将样本用提取液稀释后测定，计算公式中注意乘以稀释倍数。

3、 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

4、 由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量(单独测定)。

5、 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

6、 本试剂盒试剂足够完成 100 管反应。

7、 附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为 100T/24S）

A、上清中复合体Ⅲ活力的计算:

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。复合体Ⅲ活力(U/g 质量)=[ΔA1×V反总÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V样)÷T=262×ΔA1÷W

ΔA1：上清测定值；V反总：反应体系总体积，0.001L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×104L/mol/cm；d： 比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V提取：加入提取液体积，1.0mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

B、沉淀中复合体Ⅲ活力的计算:

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。