上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-4589

规格：100T/96S

微量法

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

工作液的配制：临用前取试剂一、试剂二、试剂三，将试剂二和试剂三依次转移到试剂一中混合溶解。

产品说明：

线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细胞色素C的氧化，并最终把电子传递给氧生成水。还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ 催化还原型细胞色素C生成氧化型细胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1.0 mL 提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。4 ℃ 600g 离心 10min。

2. 将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000g 离心 15min。

3. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4. 在沉淀中加入 400uL 提取液，超声波破碎（功率 20%，超声 5 秒，间隔 10 秒，重复 15 次），用于复合体Ⅳ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。

2、 将工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育15min；用不完的试剂4℃可保存一周；

3、 样本测定（在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入）

三、复合体Ⅳ活力单位的计算

A、按微量玻璃比色皿计算：

按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。复合体Ⅳ活力(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr

V反总：反应体系总体积，2.1×10-4L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×104 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01mL； T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，需自行测定；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

B、按96孔板计算

将上述计算公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。

注意事项：

1、 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA大于0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数），使A1-A2小于0.2，可提高检测灵敏度；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。

2、 由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量（单独测量）。

3、 本试剂盒试剂足够完成50管反应。

4、 附：使用样本重量计算公式：（检测样本数为100T/48S）

A、上清中复合体Ⅳ活力的计算：

单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=[ΔA上清×V反总÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V样)÷T=1099×ΔA上清÷W

ΔA上清：上清测定值；V反总：反应体系总体积，2.1×10-4L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×104 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V提取：加入提取液体积，1.0mL；W：样本重量，g；T：反应时间，1min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

B、沉淀中复合体Ⅳ活力的计算：

单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=[ΔA沉淀×V反总÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V样)÷T=440×ΔA沉淀÷W