上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-4580

规格：100T/96S

微量法

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 1 mL 丙酮；

2、 试剂三：溶于 1 mL 丙酮，可分装后-20℃保存。临用前再用丙酮 100 倍稀释后使用，现用现配；

3、 试剂四：临用前加入 2 mL 蒸馏水，现配现用；

4、 工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三 1:1 混合，现配现用。

产品说明：

复合体Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又称 NADH-CoQ 还原酶或 NADH 脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从 NADH 传递给 CoQ，同时可使 O₂ 还原生成 O2-，是呼吸电子传递链上产生 O2-的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态， 而且可以反映活性氧（ROS）生成状态。

复合体Ⅰ能够催化 NADH 脱氢生成 NAD+，在 340nm 下测定 NADH 的氧化速率计算出该酶活性的大小。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/ 96 孔板（UV 版）、研钵/匀浆器、丙酮、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1.0 mL 提取液，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。

2. 4℃ 600 g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g 离心 15min。

3. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4. 在沉淀中加入 400μL 提取液，超声波破碎（功率 20%，超声 5 秒，间隔 10 秒，重复 15 次），用于复合体Ⅰ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热15min。

3. 操作表：在微量石英比色皿/96孔板（UV版）中分别加入

三、复合体Ⅰ活力单位的计算

1. 以微量石英比色皿计算：

单位定义：每 mg  组织蛋白每分钟消耗 1 nmol  的 NADH  定义为一个酶活力单位。复合体Ⅰ活力（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T =1608×ΔA÷Cpr

V 反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V

样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

2. 以 96 孔板计算：

将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm 进行计算即可。

注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取 1-2 个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于 1.5），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若 ΔA 大于 0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数）；若 ΔA 偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。

2. 样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

3. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

4. 本试剂盒试剂足够完成 100 管反应。

5. 附：使用样本重量计算公式：（样本检测数为 100T/48S）

A、上清中复合体 I 活力的计算：

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

复合体 I  活性（U/g   质量）=  [ΔA1×V  反总÷（ε×d）×109]÷(W÷V  提取×V  样)÷T  =1608×ΔA1÷W ΔA1：上清测定值；V 反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 提取：加入提取液体积，1mL ；V 样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时间，2min；W： 样本重量，g；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

B、沉淀中复合体 I 活力的计算:

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

复合体 I 活性（U/g 质量）= [ΔA2×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W÷V 提取×V 样)）÷T=643×ΔA2÷W