货号:UPLC-MS-6036 | 规格:100T/48S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-6035 | 规格:50T/24S |
可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液一 |
液体 30 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
提取液二 |
液体 50 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 60 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
液体 35 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
标准品 |
粉剂×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 25 mL 试剂一,充分溶解后待用;
2、 标准品:10 mg 无水葡萄糖。临用前加入 1 mL 蒸馏水充分溶解,配成 10 mg/mL 葡萄糖溶液备用,4℃保存一周。
蔗糖转化酶(Invertase,Inv)不可逆的催化蔗糖裂解形成葡萄糖和果糖,在植物蔗糖代谢中发挥着重要作用。Inv根据最适 pH,可分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI),其中 AI 根据亚细胞定位的差异又可分为可溶性酸性转化酶( Soluble acid Invertase, SAI) 和细胞壁结合酸性转化酶( Cell wall-bound acid Invertase, CWI)。CWI 以离子键的形式结合在细胞壁上,在“库”组织韧皮部蔗糖卸载、蔗糖质外运输、植物的生长发育以及抵抗各种胁迫中起着重要作用。
CWI 催化蔗糖降解产生还原糖,还原糖与 3,5 –二硝基水杨酸反应生成在 540nm 有特征吸收峰的棕红色物质, 通过测定 540nm 处吸光值变化可计算得 CWI 活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
组织:按照质量(g): 提取液一体积(mL)为 1 : 5~10 的比例(建议称取约 0.1g,加入 1mL 提取液一)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,12000g,离心 10min,弃上清,留沉淀;沉淀中加入 1mL 蒸馏水,充分震荡混匀,4℃, 12000g,离心 10min,弃上清,留沉淀;沉淀中加入 1mL 提取液二,充分混匀,4℃浸提 15 h,4℃,12000g,离心 10min,取上清置于冰上待测。
1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 540nm,蒸馏水调零。
2、 将 10mg/mL 标准液用蒸馏水稀释为 1、0.8、0.6、0.5、0.4、0.3mg/mL 的标准溶液备用。
3、 操作表 (在 2mL 离心管中操作) :
试剂名称(µL) |
对照管 |
测定管 |
标准管 |
空白管 |
样本 |
200 |
200 |
- |
- |
标准溶液 |
- |
- |
200 |
- |
蒸馏水 |
- |
- |
- |
200 |
试剂一 |
800 |
|
800 |
800 |
试剂二 |
- |
800 |
- |
- |
混匀,37℃水浴 30min 后,95℃水浴 10 min(盖紧, 防止水分散失)。 |
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试剂三 |
500 |
500 |
500 |
500 |
混匀,95℃水浴 5 min(盖紧,防止水分散失),冷却至室温。 |
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混匀,取 1000 µL 置于 1 mL 玻璃比色皿中,测定 540nm 处吸光值A,分别记为 A 对照管,A测定管,A 标准管,A 空白管。计算 ΔA=A 测定管-A 对照管,ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。每个测定管需设一个对照管(标准曲线只需检测 1-2 次)。 |
注意:如果样本在 37℃反应后的 95℃水浴步骤中出现沉淀,建议室温 12000g,离心 5min,取上清(若上清不足 1000µL,可按比例缩小加样体系,如 800µL 上清+400µL 试剂三)进行下一步操作。
1、 标准曲线的绘制:
以各个标准溶液的浓度为 x 轴,其对应的 ΔA 标准为 y 轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y=kx+b,将 ΔA 带入方程得到 x(mg/mL)。
2、 CWI 活性的计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
酶活定义:37℃每 mg 蛋白每分钟分解蔗糖产生 1µg 还原糖为 1 个酶活力单位。CWI 酶活(U/mg prot)= x×V 提取÷(V 提取×Cpr)×103÷T = 33.33x÷Cpr
(2) 按样本质量计算
酶活定义:37℃每 g 样本每分钟分解蔗糖产生 1µg 还原糖为 1 个酶活力单位。CWI 酶活(U/g 质量)= x×V 提取×103÷W÷T = 33.33x÷W
V 提取:提取液体积,1mL;103:单位换算系数,1mg=103µg;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间,30min。
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