上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-4184	规格：100T/48S	微量法
货号：UPLC-MS-4183	规格：50T/24S	紫外分光光度法

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 0.5 mL 蒸馏水，充分混匀；

2、 试剂三：临用前加入 0.5mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；

3、 试剂四：临用前加入 1.25 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；

4、 试剂五：临用前每支加入 1 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；一支即可做 100T，为延长试剂盒使用时间故多给一支。

5、 试剂六：临用前每支加入 1 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；一支即可做 100T，为延长试剂盒使用时间故多给一支。

6、 试剂七：临用前加入 2 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；

7、 工作液的配制：临用前根据实验所需用量，按照试剂一：试剂二：试剂三：试剂四 =148μL: 4μL: 4μL:4μL（1T 的量）的比例，充分混匀，现用现配。

产品说明：

糖原磷酸化酶是糖原分解代谢中的关键酶，催化糖原的磷酸化反应。该酶分为有活性的糖原磷酸化酶 a（Glycogen phosphorylase a, GPa）和无活性的糖原磷酸化酶 b（Glycogen phosphorylase b, GPb）两种形式。糖原的分解主要在糖原磷酸化酶 a 的催化下进行。未添加激活剂时，糖原磷酸化酶 a 催化糖原和无机磷产生葡萄糖残 基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化 NADP 还原生成 NADPH， 在 340nm 下测定NADPH 上升速率，即可反映糖原磷酸化酶a 活性。添加激活剂测定G（GPa 和GPb）总活性， 未添加激活剂时测定 GPa 活性，GP 活性-GPa 活性得到GPb 活性。

在 340nm 下测定 NADPH 上升速率，即可反映糖原磷酸化酶a 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、研钵/匀浆器、电子天平、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入 1 mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 8000 g，4℃，离心 10 min，取上清置于冰上待测。

2、血清（浆）：直接检测。若有浑浊可以离心后取上清进行测定。

3、细菌或者细胞：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液， 超声波破碎细菌或细胞（功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长至 340 nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 工作液置于 37℃预热 5min。

3、 GPa 活性:在石英比色皿或 96 孔 UV 板中依次加入 10 μL 样本、10 μL 试剂五、10 μL 试剂六、10 μL 蒸馏水、160 μL 工作液，充分混匀 10s，记录 340nm 处 10s 时吸光值 A1，37℃水浴锅或者恒温培养箱反应 10min（酶标仪有控温功能的可以调节温度至 37℃），反应后拿出迅速擦干测定 10min10s 时吸光值A2。计算 ΔAGPa=A2- A1。

4、 GP 活性: 在石英比色皿或 96 孔 UV 板中依次加入 10 μL 样本、10 μL 试剂五、10 μL 试剂六、10 μL 试剂七、160 μL 工作液，充分混匀 10s，记录 340nm 处 10s 时吸光值 A3，37℃水浴锅或者恒温培养箱反应 10min（酶标仪有控温功能的可以调节温度至 37℃），反应后拿出迅速擦干测定 10min10s 时吸光值 A4。计算 ΔAGP=A4-A3。

三、糖原磷酸化酶 b(GPb)活性计算

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

         （1） 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GPb（U/mg prot）＝[(ΔAGP-ΔAGPa)×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×(ΔAGP-ΔAGPa)÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位定义：每g 组织每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GPb（U/g 质量）＝[(ΔAGP-ΔAGPa)×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=321.54×(ΔAGP-ΔAGPa)÷W

（3） 按样本体积计算

单位定义：每 mL 液体每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位

GPa（U/mL）=[(ΔAGP-ΔAGPa) ×V 反总÷(ε×d)×10⁹] ÷V 样÷T=321.54× (ΔAGP-ΔAGPa)

（4） 按细胞数量计算