一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入 1 mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 8000 g，4℃，离心 10 min，取上清置于冰上待测。

2、细菌或者细胞：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液， 超声波破碎细菌或细胞（功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）：直接检测。若有浑浊可以离心后取上清进行测定。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 340 nm，蒸馏水调零。

2、 临用前工作液置于 37℃预热 5min。在石英比色皿中依次加入 50 μL  样本、50 μL 试剂五、50 μL 试剂六、850 μL 工作液，充分混匀 10s，记录 340nm处 10s 时吸光值A1，37℃水浴锅或者恒温培养箱反应 10min，反应后拿出迅速擦干测定 10min10s 时吸光值A2。计算ΔA = A2- A1。空白管只需做 1-2 次。

三、糖原磷酸化酶 a (GPa)活性计算

1. 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GPa（U/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(V 样×Cpr) ÷T= 321.54×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算

单位定义：每g 组织每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GPa（U/g 质量）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=32 1.54×ΔA÷W

3. 按样本体积计算

单位定义：每 mL 液体每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位

GPa（U/mL）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9] ÷V 样÷T=321.54×ΔA

4. 按细胞数量计算

单位定义：每 1 万个细胞每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GPa（U/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9] ÷( 细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=321.54×ΔA÷细胞数量

V 反总：反应体系总体积，1×10 -3 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10 3 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；W：样本质量，g；细胞数量：以万计；109:换算单位，1mol=109 nmol。

注意事项：

1、如果测定吸光值 ΔA＞0.8，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数；如果测定吸光值较低或接近空白 OD 值，建议增加反应中的样本体积或者样本质量后再进行测定。