酸性木聚糖酶(ACX)活性检测试剂盒-酸性木聚糖酶(ACX)试剂盒-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-4237 规格:100T/48S 微量法
货号:UPLC-MS-4236 规格:50T/24S 可见分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

缓冲液

液体 90 mL×1

2-8℃保存

试剂一

液体 2mL×1

2-8℃保存

试剂二

液体 10 mL×1

2-8℃保存

试剂三

液体 4 mL×1

2-8℃保存

标准品

粉剂×1

2-8℃保存

溶液的配制:

1、试剂一:临用前加入 6mL 蒸馏水,4℃保存 3 个月。

2、标准品:10mg 木糖。临用前加入 667μL 缓冲液配成 100μmol/mL 的标准品溶液,2-8℃保存 8 周。

产品说明:

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物产生,能催化水解木聚糖,也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶,可分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及 β-葡聚糖,降低酿造中物料的粘度,促进有效物质的释放,以及降低饲料中的非淀粉多糖,促进营养物质的吸收利用,因而广泛的应用于酿造和饲料工业中,酸性木聚糖酶(ACX)一般分离自耐酸的真菌,细菌及部分霉菌。

ACX 在酸性环境下能将木聚糖降解成还原性寡糖和单糖,进一步在沸水浴条件下与 3,5-二硝基水杨酸发生显色反应,在 540nm 处有特征吸收峰,反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比,通过测定反应液在 540nm吸光值增加速率,可计算ACX 活力。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。


需自备的仪器和用品:

天平、低温离心机、恒温水浴锅,可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、可调式移液枪、冰、蒸馏水。


 操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1. 发酵液:发酵液于 8000rpm,4℃,离心 15min,取上清,作为待测样本。

2. 酶干粉:称约 1mg,加 1mL 缓冲液溶解,蒸馏水稀释 10 倍待测。

3. 组织样本:称约 0.1g 组织,加入 1mL 缓冲液,冰上充分研磨。8000rpm,4℃,离心 15min,取上清蒸馏水稀 10 倍待测。

二、测定步骤

1 可见分光光度计/酶标仪预热30min 以上,调节波长至540nm,可见分光光度计蒸馏水调零。

2 标准品稀释:取20μL 100μmol/mL木糖标准液,加入980μL缓冲液,充分混匀,配制成2μmol/mL的木糖标准液备用,现用现配。(实验中每管需要60μL,为减小实验误差,故配制大体积。)

3 样本测定:(在EP管中加入下列试剂)

试剂名称(μL

对照管

测定管

空白管

标准管

样本

60

60

-

-

2μmol/mL木糖标准品

-

-

-

60

缓冲液

90

90

150

90

试剂一

-

60

60

60

混匀,50℃水浴中反应30min,立即沸水浴中10min灭活。(注意不要让盖子爆开,以免进水,改变了反应体系)

试剂一

60

-

-

-

试剂二

90

90

90

90

试剂三

30

30

30

30

混匀,沸水浴中显色5min(注意不要让盖子爆开,以免进水改变了反应体系),冷却后吸取200μL96孔板或比色皿中,尽快测定各管540nm下的吸光度,分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。空白管和标准管只需做1-2次。

三、ACX活性计算

1、发酵液ACX 活力计算:

酶活定义:50℃,pH4.8 条件下,每毫升发酵液每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。

ACX 活力(U/mL)= C 标准×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷T= 0.067×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)

C 标准:木糖标准溶液浓度,2μmol/mL;T:反应时间,30min。

2、酶干粉ACX 活力计算:

酶活定义:50℃,pH4.8 条件下,每毫克酶每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。

ACX 活力(U/mg= 10×C 标准×A 测定-A 对照)÷A 标准-A 空白)×V 提取÷W1÷T= 0.67×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷W1

10:样本稀释倍数,10 倍;C 标准:木糖标准溶液浓度,2μmol/mLV 提取:加入缓冲液体积,1mLW1 酶干粉重量,mg;T:反应时间,30min。

3、组织中ACX 活力计算:

             (1) 按样本蛋白浓度计算:

酶活定义:50 ,pH 4.8 条件下,每 mg 组织蛋白每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。

ACX 活力(U/mg prot)= 10×C 标准×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)×V 样本÷(V 样本×Cpr)÷T= 0.67×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷Cpr

(2) 按样本质量计算:

酶活定义:50℃,pH4.8 条件下,每克组织每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。

ACX 活力(U/g 质量)= 10×C 标准×A 测定-A 对照)÷A 标准-A 空白)×V 提取÷W2÷T= 0.67×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷W2

10:样本稀释倍数,10 倍;C 标准:木糖标准溶液浓度,2μmol/mLV 提取:加入缓冲液体积,1mLW2 样本质量,g;T:反应时间,30min;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;V 样本:加入的样本体积,0.06mL。

注意事项:

吸光度变化应该控制在 0.01~1.5 之间,否则加大样本量或稀释样本,注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。



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