酸性转化酶(AI)活性检测试剂盒-酸性转化酶(AI)试剂盒-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-4153 规格:100T/48S 微量法
货号:UPLC-MS-4152 规格:50T/24S 可见分光光度法

产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 100mL×1

4℃保存

试剂一

液体 40 mL×1

4℃保存

试剂二

粉剂×1

4℃保存

试剂三

液体 20 mL×1

4℃保存

标准品

粉剂×1

4℃保存

溶液的配制:

1、试剂二:临用前加入 20mL 试剂一充分溶解备用;用不完的试剂 4℃保存;

2、标准品:10mg 葡萄糖,临用前加入 1mL 蒸馏水溶解,制备 10mg/mL 葡萄糖标准液备用。

产品说明:

蔗糖转化酶(Invertase,Ivr)催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 pH,Ivr 分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两种类型。AI(EC 3.2.1.26)主要存在于细胞液泡或自由空间中,最适 pH   4.5~5.0(酸性),通过降解液泡中蔗糖,调节液泡中蔗糖的利用和果实内糖类的积累。

AI 催化蔗糖降解产生还原糖,进一步与 3,5-二硝基水杨酸反应,生成棕红色氨基化合物,在 540nm 有特征光吸收,在一定范围内 540nm 光吸收增加速率与 AI 活性成正比。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

按照组织质量(g):提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。12000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

二、测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 540nm,蒸馏水调零。

2、标准品的制备:将标准液用蒸馏水稀释成 2、1.5、1.0、0.5、0.25、0 mg/mL 葡萄糖标准液。

3、操作表(在 1.5mL EP 管中依次加入下列试剂):

试剂名称(μL

测定管

对照管

标准管

样本

50

50

-

试剂一

-

200

-

试剂二

200

-

200

标准液

-

-

50

混匀, 37℃准确水浴30min后,煮沸10min左右(盖紧,以防水分散失),流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变),12000 g4℃离心5min,取上清。

上清

200

200

200

试剂三

125

125

125

混匀,煮沸 10min 左右(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀,取 200μL 至微量玻璃比色皿或 96孔板中,540nm 处记录各管吸光值 A,计算 ΔA=A 测定-A 对照。

三、AI 活性计算

1、标准曲线的建立

以各浓度下吸光值减空白管(浓度为0mg/mL)的吸光度为y轴,葡萄糖浓度为x轴绘制标准曲线。根据标准曲线,将ΔA带入方程得到x(mg/mL)。

2 AI活性计算

          (1) 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:37℃ mg 蛋白每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。

AI活性(U/mg prot)=(x×V1×1000)÷(V1×Cpr)÷T=33.3×x÷Cpr

(2) 按样本质量计算:

单位的定义:37℃ g 组织每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。

AI活性(U/g 质量)=(x×V1×1000)÷(W×V1÷V2)÷T=33.3×x÷W

1000:单位换算系数,1 mg/mL =1000µg/mL;V1:加入反应体系中样本体积,0.05mL;V2:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间:30min。

注意事项:

1、如果加入试剂三,煮沸10min后有混浊物出现,建议离心除去沉淀后,取上清测定吸光度;

2、如果吸光值大于1,可以用蒸馏水将样本稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数)。

3、由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约1mg/mL),所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。


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