山梨醇脱氢酶(SDH)活性检测试剂盒-山梨醇脱氢酶(SDH)试剂盒-上海液质



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货号:UPLC-MS-4248 规格:100T/96S 微量法
货号:UPLC-MS-4247 规格:50T/24S 可见分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 60 mL×1

2-8℃保存

试剂一

粉剂×5

2-8℃保存

试剂二

液体 12mL×1

2-8℃保存

试剂三

液体 12mL×1

2-8℃保存

试剂四

粉剂×5

-20℃保存

试剂五

液体 55 mL×1

2-8℃保存

标准品

粉剂×1

-20℃保存

溶液的配制:

1 试剂一:取 10 mL 试剂五加入 1 瓶试剂一粉剂中溶解,再加入一支试剂四,现用现配,24 h 变质;

2 标准品:临用前加入 1.4 mL 蒸馏水,即 10 μmol/mL NADH 标准品。-20℃保存 4 周,避免反复冻融。

产品说明:

SDH(EC 1.1.1.14)催化山梨醇脱氢生成果糖,是调控生物体内山梨醇含量的关健酶之一。SDH 催化山梨醇脱氢生成果糖,同时还原 NAD+生成 NADH,生成的 NADH 能将电子传递给 NBT 生成紫色的甲臜,根据这一原理可以计算 SDH 活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、超声破碎仪,1mL玻璃比色皿、研钵/ 匀浆器、冰和蒸馏水。

 操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例加入提取液(建议 500 万细菌或细胞加入 1 mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000×g 4℃离心 10 min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10  的比例(建议称取约 0.1 g  组织,加入 1 mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000 ×g 4℃离心 10 min,取上清,置冰上待测。

3、血清(浆)样本:直接检测。

二、测定步骤

1、可见分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 570 nm,蒸馏水调零。

2、标准管的测定:将 10 μmol/mL NADH 标准品用水稀释至 1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3 μmol/mL 的标准溶液

(1) 标准品稀释表

序号

稀释前浓度(µmol/mL

标准液体积(µL

蒸馏水体积(µL

稀释后浓度µmol/mL

1

10

100

900

1

2

1

180

20

0.9

3

1

160

40

0.8

4

1

140

60

0.7

5

1

120

80

0.6

6

1

100

100

0.5

7

1

80

120

0.4

8

1

60

140

0.3

实验中每个标准管需 100µL 标准溶液。

(2) 标准品测定表

试剂名称(μL)

标准管

空白管

标准溶液

100

-

蒸馏水

-

100

试剂二

150

150

试剂三

150

150

试剂一

600

600

混匀后室温避光放置 20 min,之后分别测定标准管和空白管在 570 nm 下的吸光度,记为A 标准管、A

白管,计算 ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。标准曲线只需做 1-2 次。

3、样本的测定:

试剂名称(μL)

测定管

样本

100

试剂二

150

试剂三

150

试剂一

600

将上述试剂按顺序加 1 mL 玻璃比色皿中,加样本的同时开始计时,记录 10 秒时的初始吸光度 A1

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