上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测,Elisa代测,HPLC 检测,GC检测,GC-MS 检测,LC-MS检测,ICP-MS检测 、土壤、植物、动物,成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购
货号:UPLC-MS-4246 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4245 | 规格:50T/48S | 紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 120 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
粉剂×1 瓶 |
-20℃保存 |
试剂二 |
液体×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
液体 25 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 提取液:内含不溶物,使用前摇匀。
2、 试剂一:临用前加入 5 mL 试剂三溶解。可溶解后分装-20℃保存,避免反复冻融。
3、 试剂二:液体置于试剂瓶内玻璃管中。临用前加入 15 mL 乙醇充分混匀,配好后 4℃保存。
4、 工作液的配制:将试剂一、试剂二、试剂三按 1:1:2(V:V:V)的比例配制工作液,工作液现用现配。
CAD 是木质素生物合成途径中的关键酶之一,催化香豆醛、芥子醛以及松柏醛等生成与之相应的肉桂醇。该酶多存在于高等植物、酵母、菌类中,研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理,为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。
CAD 催化肉桂醛和NADPH生成肉桂醇和NADP+,在340nm下测定NADPH消耗速率,即可反映CAD活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、乙醇和蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液) 进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,紫外分光光度计蒸馏水调零。
2、 操作表:在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂:
试剂名称 |
空白管 |
测定管 |
样本(µL) |
|
20 |
蒸馏水(µL) |
20 |
|
工作液(µL) |
180 |
180 |
在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分别加入上述试剂,充分混匀后于 340nm 处测定 10s 时的吸光值 A1, 迅速置于 25℃水浴或培养箱 5min(酶标仪有控温功能可将温度调至 25℃),拿出迅速擦干测定 5min10s 时的吸光值 A2,计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管(空白管只需做 1-2 次)。 |
A、按微量石英比色皿计算:
1、按蛋白浓度计算
酶活定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
CAD酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×Cpr)÷T=321.54×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算
酶活定义:每g组织每分钟消耗1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
CAD酶活(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T=321.54×ΔA÷W
3、按细菌或细胞数量计算
酶活定义:每104个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
CAD酶活(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T= 0.643×ΔA
ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103L/mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,2×10-4L;V 样:反应体系中样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间,5min;500:细菌或细胞总数,500万;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
B、按96孔UV板计算:
将将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。
1、 当 A1 小于 0.8,建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。
2、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过 0.04。
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