羟脯氨酸(HYP)含量检测试剂盒-羟脯氨酸(HYP)检测试剂盒-上海液质



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货号:UPLC-MS-4467 规格:100T/96S 微量法
货号:UPLC-MS-4466 规格:50T/48S 可见分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 100mL×1 瓶(自备)

常温保存

试剂一

液体 15 mL×1

4℃保存

试剂二

液体 15 mL×1

4℃保存

标准液

液体 1 mL×1

4℃保存

溶液的配制:

1. 提取液:自备 6 mol/L 盐酸。6 mol/L 盐酸的配制:浓盐酸(37%) H2的体积比是 1:1。

2. 标准液:0.5 mg/mL 羟脯氨酸标准液。

产品说明:

HYP 是机体胶原蛋白主要成分之一,胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等,因此 HYP 含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。

样本经酸水解产生游离的 HYP,进一步被氯胺 T 氧化,氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应,产生红色化合物, 560nm 处有特征吸收峰。通过测定样本水解液 560nm 吸光值,可计算 HYP 含量。

技术指标:

最低检出限:0.051 μg/mL

线性范围:0.117-7.5 μg/mL

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

天平、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、6mol/L 盐酸和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、组织:称取约 0.2g 样本于玻璃管,将组织尽量剪碎以便消化,盖子稍松不密闭。加入 2mL 的提取液,煮沸或 110℃ 烘箱 2 6 小时消化至没有可见大的团块,冷却后用 10mol/L NaOH( 1mL)调节 pH 值至 6-8 范围内(不可过酸或过碱),再蒸馏水定容至 4mL。最后 16000rpm,25℃,离心 20min(若离心后仍有杂质,可通过过滤去除),

取上清待测。(过程中可能有黑色物质生成,若长时间不能消化,可能为碳化的物质,不影响实验)

2. 细胞:取 500 万个细胞,加入 1mL 的提取液,煮沸或 110℃烘箱小时消化至透明状,冷却后用 10mol/L NaOH( 0.5mL)调节 pH 值至 6-8 范围内(不可过酸或过碱),蒸馏水定容至 2mL,16000rpm,25℃,离心 20min,取上清待测。

二、测定步骤

1 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 560nm,蒸馏水调零。

2 将标准液用蒸馏水稀释为 7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234、0.117µg/mL 的标准溶液。

3 按下表进行操作:

 

空白管

测定管

标准管

样本(μL

 

200

 

标准溶液(μL

 

 

200

试剂一(μL

200

200

200

混匀,室温静置 20min

试剂二(μL

200

200

200

H2OμL

600

400

400

混匀,60℃,水浴 20min,取出后室温静置 15 min,用 1mL 比色皿,在 560nm 下分别测定空白管、测定管、标准管的 OD 值,并记为 A 空白管、A 测定管、A 标准管。

三、羟脯氨酸含量计算公式

1. 标准曲线的绘制:

以标准溶液的浓度为 x 轴,∆A 标准(∆A 标准=A 标准管-A 空白管) y 轴,绘制标准曲线,得到方程 y=kx+b。将∆A 测定(∆A 测定=A 测定管-A 空白管)带入方程得到 x(µg/mL)。

2. 羟脯氨酸含量的测定:

(1) 按样本质量计算:

组织羟脯氨酸含量(µg/g 质量)= x×V 样本÷(W×V 样本÷V 组提)=4x÷W

(2) 按样本蛋白浓度计算:

组织羟脯氨酸含量(µg/mg prot)= x×V 样本÷(Cpr×V 样本)=x÷Cpr

(3) 按细菌或细胞数量计算:

细胞羟脯氨酸含量(µg/104 cell)= x×V 样本÷(细胞数量×V 样本÷V 胞提)=2x÷细胞数量

V 样本:加入的样本体积,0.2mL;V 组提:组织提取液体积,4mL;V 胞提:细胞提取液体积,2mL;W 样本质量,g;细胞数量:以 104 为单位,万个;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL。

注意事项:

1 如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

2 试剂有一定的毒性,请操作时做好防护措施,防止吸入或与皮肤接触。

3 按样本蛋白浓度计算时,需单独提取样本中的蛋白质并测定。


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