肉桂酸-4-羟化酶(C4H)活性检测试剂盒-肉桂酸-4-羟化酶(C4H)试剂盒-上海液质



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货号:UPLC-MS-4252 规格:100T/96S 微量法
货号:UPLC-MS-4251 规格:50T/48S 紫外分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 100 mL×1

2-8℃保存

试剂一

液体 20 mL×1

2-8℃保存

试剂二

粉剂×2

2-8℃保存

试剂三

粉剂×2

2-8℃保存

溶液的配制:

1 试剂二:临用前加入 2 mL 乙醇溶解备用。2-8℃保存 4 周。

2 试剂三:临用前每瓶加入 2 mL 双蒸水充分溶解待用。现配现用。-20℃分装可保存 4 周,避免反复冻融。

产品说明:

C4H又称反式肉桂酸-4-单氧化酶,是催化桂皮酸形成咖啡豆、香豆酸的酶。C4H多存在于高等植物、酵母、   菌类中,属于细胞木质素合成途径中间的关键酶。

C4H催化肉桂酸和NADPH生成4-香豆酸盐和NADP,在340nm下测定NADPH的减少速率,即可反映C4H活性。   

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、   乙醇、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 15 分钟,取上清,置冰上待测。

2、细胞或细菌样本的制备:先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。12000g,4℃离心 15min,取上清, 置冰上待测。

二、测定步骤

1 紫外分光光度计/酶标仪预热30min,波长调至340nm,蒸馏水调零。

2 加样表(微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入)

试剂一

140

试剂二

20

试剂三

20

样本

20

 充分混匀后立即测定 10s 时在 340nm 下的吸光度,记为 A1,之后迅速将其放入 37℃水浴或 37℃培养箱中 3min

(若酶标仪带有控温功能,将温度调为 37℃)。然后迅速拿出擦净后测定 190s 时的吸光度,记为 A2。计算ΔA=A1-A2。

三、C4H酶活计算

A、按微量石英比色皿计算:

1、按蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟减少1nmol NADPH的酶量定义为一个酶活性单位。C4H酶活(U/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×109×V反总]÷(V样×Cpr)÷T =535.91×ΔA÷Cpr

2、按样本质量计算:

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟减少1nmol NADPH的酶量定义为一个酶活性单位。C4H酶活(U/g 质量)=[ΔA÷(ε×d) ×109×V反总]÷(W÷V提取×V样)÷T =535.91×ΔA÷W

3、按细胞或细菌个数计算:

单位的定义:每104个细胞或细菌在反应体系中每分钟减少1nmolNADPH的酶量定义为一个酶活性单位。

C4H酶活(U/104 cell)=[ΔA÷(ε×d) ×109×V反总]÷(500÷V提取×V样)÷T =1.072×ΔA

V反总:反应总体积,2×10-4L;ε:NADPH的摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样: 加入的样本体积,0.02mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;V提取:提取液体积,1mL;500 500万个细胞;T:反应时间,3min;109:单位换算系数,1mol=109nmol。

B、按96UV板计算:

将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。

注意事项:

当ΔA大于0.4时,建议将样本用提取液稀释后测量;ΔA过小时,建议增加酶促反应时间(5min或10min)或增   加加入的样本体积来测定。


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