上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测,Elisa代测,HPLC 检测,GC检测,GC-MS 检测,LC-MS检测,ICP-MS检测 、土壤、植物、动物,成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购
货号:UPLC-MS-4565 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4564 | 规格:50T/24S |
可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 60 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 50 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×2 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1. 工作液的配制:一瓶试剂二用 25 mL 试剂一溶解。现用现配。
漆酶(CE1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,属于铜蓝氧化酶家族,漆酶存在菇、菌及植物中,是一种环保型酶,其独特的催化性质在生物检测中有广泛的应用。
漆酶分解底物ABTS产生ABTS自由基,在420nm处的吸光系数远大于底物ABTS,测定ABTS自由基的增加速率,可计算得漆酶活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、天平、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水,水浴锅
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液), 进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、细胞:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 4℃,10000g 离心 10min, 取上清置于冰上待测。
3、培养液:直接检测。
1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 420nm,蒸馏水调零。
2、 水浴锅温度调至 45℃。
3、 操作表:在 1mL 玻璃比色皿中分别加入下列试剂:
样本名称 |
测定管 |
空白管 |
样本(μL) |
150 |
|
蒸馏水(μL) |
- |
150 |
工作液(μL) |
850 |
850 |
在 1mL 玻璃比色皿中分别加入上述试剂,充分混匀后于 420nm 处测定 10s 时的吸光值 A1,迅速置于 45℃ 水浴 3min,拿出迅速擦干测定 190s 时的吸光值 A2,计算 ΔA 测定管=A2 测定-A1 测定,ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。(空白管只需做 1-2 次) |
1、按蛋白浓度计算
酶活定义:每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。漆酶酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×Cpr)÷T=61.7×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算
酶活定义:每克样本每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶酶活(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×W÷V 样总)÷T=61.7×ΔA÷W
3、按细胞数量计算
酶活定义:每 104 个细胞每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。漆酶酶活(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×500÷V 样总)÷T=0.123×ΔA
4、按液体体积计算
酶活定义:每 mL 液体每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。漆酶酶活(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷V 样÷T=61.7×ΔA
ε:ABTS 摩尔消光系数:36000L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应总体积,0.001L;V 样:反应中样本体积,0.15mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度需自行测定;W, 样本质量,g;T:反应时间,3min;500:细胞总数,500 万;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
1、工作液需临用前配制,并且尽快使用,4℃保存一周,若变色则不能使用。
2、测定之前进行预实验,若吸光值较高,请将样本用提取液进行适当的稀释再测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。
3、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,OD 值变化不超过 0.05。
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