| 货号：UPLC-MS-4211 | 规格：100T/96S | 微量法 |
| 货号：UPLC-MS-4210 | 规格：50T/48S | 紫外分光光度法 |
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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提取液 |
液体 100 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂一 |
液体 25 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂二 |
粉剂×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂三 |
粉剂×1 瓶 |
-20℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前加入 7.5 mL 试剂一溶解，用不完的试剂 2-8℃保存 8 周；
2、 试剂三：临用前每瓶加入 5 mL 试剂一溶解，用不完的试剂建议分装后-20℃避光可保存 4 周；
3、 工作液的配制：按照试剂一：试剂二：试剂三为 4：3：2 的体积比例充分混匀，现用现配，用前 37℃预热 10 min。
产品说明：
GCDH（EC 1.1.1.47）催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H，主要存在于多种微生物和高等动物的肝脏中。GCDH是一种制备高含量低聚果糖的理想用酶，同时也是临床血糖测定的诊断用酶，可广泛用于食品工业及医药工业领域中。
GCDH催化D-葡萄糖和NAD生成D-葡萄糖酸和NADH，利用NADH在340nm处吸光值的变化即可反映葡萄糖脱氢酶的活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：按照组织质量（g）︰提取液体积(mL)为1︰5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后，8000g，4℃，离心10 min，取上清置于冰上待测。细胞或细菌：先收集细胞或细菌到离心管内，离心后弃上清；
按照细胞数量（104个）︰提取液体积（mL） 为500~1000︰1的比例（建议500万个细胞或细菌加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率20%或200 W，超声3s，间隔7s，总时间5min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
血清（浆）：直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 操作表：在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分别加入下列试剂：
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试剂名称（µL ） |
空白管 |
测定管 |
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工作液 |
180 |
180 |
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蒸馏水 |
20 |
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样本 |
- |
20 |
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加入工作液即开始计时，立即混匀，于 340nm 处测定 10s 时的吸光值A1，迅速置于 37℃水浴或培养箱 1min （酶标仪有控温功能可将温度调至 37℃），拿出迅速擦干测定 1min 10s 时的吸光值A2，计算 ΔA 测定管=A2 测定 -A1 测定，ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管（空白管只需做 1-2 次）。 |
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A、按微量石英比色皿计算：
1. 按样本蛋白浓度计算
酶活定义：每毫克蛋白每分钟产生 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
GCDH 酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10 9×V 反总÷（V 样×Cpr ）÷T=1607.7×ΔA÷Cpr
2. 按样本质量计算
酶活定义：每克样本每分钟产生 1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。
GCDH 酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×10 9×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T =1607.7×ΔA÷W
3. 按细胞或细胞数量计算
酶活定义：每 104 个细胞每分钟产生 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
GCDH 酶活（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×10 9×V 反总÷（V 样÷V 样总×细胞数量（万个））÷T=1607.7×ΔA÷细胞数量（万个）
4. 按液体体积计算
酶活定义：每 mL 样本每分钟产生 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
GCDH 酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×10 9×V 反总÷V 样÷T=1607.7×ΔA
ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10 3L/ mol /cm；d：比色皿光径，1cm；109：单位换算系数，1mol=109nmol； V 反总：反应体系总体积，2×10 -4L；V 样：反应体系中样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr： 样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1min。
将上述公式中的d-1cm 改为 d-0.6cm（96 孔板光径）进行计算即可。
注意事项：
1、 样本提取上清液置于冰上待测，且样本提取完成后建议当天提取当天内测完。
2、 当 A1 或 A2 大于 1.7 时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。
3、 当 ΔA 大于 1.5 时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。
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