莽草酸脱氢酶(SD)活性检测试剂盒-莽草酸脱氢酶(SD)试剂盒-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-4469 规格:100T/96S 微量法
货号:UPLC-MS-4468 规格:50T/48S 紫外分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 100 mL×1

4℃保存

试剂一

液体 10 mL×1

4℃保存

试剂二

粉剂×1

4℃保存

试剂三

粉剂×1

-20℃保存

溶液的配制:

1 提取液:内含不溶物,用前摇匀。

2 试剂二:临用前加入 5 mL 蒸馏水溶解。

3 试剂三:临用前每瓶加入 10 mL 蒸馏水溶解。

4 工作液的配制:根据用量按照试剂一:试剂二:试剂三为 7:4:8 的体积比例充分混匀,备用,用前 25℃预 15min。

产品说明:

莽草酸途径是存在于植物和微生物中的一条重要的代谢途径,莽草酸脱氢酶(EC 1.1.1.25) 是莽草酸合成代谢途径中催化第四步反应的关键酶。莽草酸脱氢酶催化莽草酸和NADP产生NADPH,检测340nm下的吸光值增加速率来表示SD活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液(加入前摇匀))进行冰浴匀浆,然后,8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

2、细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3、液体:直接检测。

二、测定步骤

1 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2 操作表:在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂

试剂名称

空白管

测定管

工作液(µL

190

190

样本(µL

 

10

蒸馏水(µL

10

 

加入样本即开始计时,充分混匀后于 340nm 处测定 20s 时的吸光值 A1 5min20s 时的吸光值 A2 计算 ΔA 测定管=A2 测定-A1 测定,ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管(空白管只需做 1-2 次)。

三、SD酶活计算

A、按微量石英比色皿计算:

1. 按蛋白浓度计算

酶活定义:每毫克蛋白每分钟产生 1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。SD酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr

2. 按样本质量计算

酶活定义:每克样本每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

SD酶活(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T=643×ΔA÷W

3. 按细胞数量计算

酶活定义:每104个细胞每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

SD酶活(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量(万个))÷T=643×ΔA÷细胞数量(万个)

4. 按液体体积计算

酶活定义:每mL样每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

SD酶活(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷V样÷T=643×ΔA

ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103L/mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,2×10-4L;V 样:反应体系中样本体积,0.01mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,5min;109 单位换算系数,1mol=109nmol;V样总:加入提取液体积,1mL。

B、按96UV板计算:

将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。

注意事项:

1. 样本提取上清液置于冰上待测,且样本提取完成后建议2h内测完。

2. 样本的蛋白浓度需自行测定,由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约1 mg/mL),所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。

3. ΔA大于1时,建议将样本稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时,可以延长反应时间(10min或15min)来测定。

4. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过0.01。


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