上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测,Elisa代测,HPLC 检测,GC检测,GC-MS 检测,LC-MS检测,ICP-MS检测 、土壤、植物、动物,成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购
货号:UPLC-MS-4469 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4468 | 规格:50T/48S | 紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 100 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 10 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
粉剂×1 瓶 |
-20℃保存 |
溶液的配制:
1、 提取液:内含不溶物,用前摇匀。
2、 试剂二:临用前加入 5 mL 蒸馏水溶解。
3、 试剂三:临用前每瓶加入 10 mL 蒸馏水溶解。
4、 工作液的配制:根据用量按照试剂一:试剂二:试剂三为 7:4:8 的体积比例充分混匀,备用,用前 25℃预热 15min。
莽草酸途径是存在于植物和微生物中的一条重要的代谢途径,莽草酸脱氢酶(EC 1.1.1.25) 是莽草酸合成代谢途径中催化第四步反应的关键酶。莽草酸脱氢酶催化莽草酸和NADP产生NADPH,检测340nm下的吸光值增加速率来表示SD活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液(加入前摇匀))进行冰浴匀浆,然后,8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
2、细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
3、液体:直接检测。
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 操作表:在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂
试剂名称 |
空白管 |
测定管 |
工作液(µL) |
190 |
190 |
样本(µL) |
|
10 |
蒸馏水(µL) |
10 |
|
加入样本即开始计时,充分混匀后于 340nm 处测定 20s 时的吸光值 A1 和 5min20s 时的吸光值 A2, 计算 ΔA 测定管=A2 测定-A1 测定,ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管(空白管只需做 1-2 次)。 |
A、按微量石英比色皿计算:
1. 按蛋白浓度计算
酶活定义:每毫克蛋白每分钟产生 1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。SD酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr
2. 按样本质量计算
酶活定义:每克样本每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
SD酶活(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T=643×ΔA÷W
3. 按细胞数量计算
酶活定义:每104个细胞每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
SD酶活(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量(万个))÷T=643×ΔA÷细胞数量(万个)
4. 按液体体积计算
酶活定义:每mL样每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
SD酶活(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷V样÷T=643×ΔA
ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103L/mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,2×10-4L;V 样:反应体系中样本体积,0.01mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,5min;109: 单位换算系数,1mol=109nmol;V样总:加入提取液体积,1mL。
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。
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