上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测,Elisa代测,HPLC 检测,GC检测,GC-MS 检测,LC-MS检测,ICP-MS检测 、土壤、植物、动物,成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购
货号:UPLC-MS-4485 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4484 | 规格:50T/48S |
紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 100 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 10 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×1 瓶 |
-20℃保存 |
试剂三 |
液体 5 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前溶于 1.6 mL 甲醇中,再用水定容至 10 mL。可分装后-20℃保存,避免反复冻融。
糜蛋白酶,又称胰凝乳蛋白酶,是胰腺分泌的一种蛋白水解酶,能迅速分解变性蛋白质。糜蛋白酶的功能与胰蛋白酶相似,但是具有分解能力强、毒性低和不良反应小等优点。临床上糜蛋白酶用于痰液稀化,对脓性和非脓性痰液均有效;也用于创伤或手术后伤口愈合,如白内障摘除。
糜蛋白酶催化 BTEE 水解,产物在 256nm 有特征光吸收;通过测定 256nm 光吸收增加速率,来计算糜蛋白酶活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/ 96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)1:5-10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清即粗酶液。
2. 血清(浆):直接检测。
1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至256nm,蒸馏水调零。
2、 试剂一置于25℃水浴中保温30min。
3、 样本测定:
试剂名称(μL) |
测定管 |
试剂一 |
90 |
试剂二 |
90 |
试剂三 |
20 |
样本 |
20 |
将上述试剂分别加入微量石英比色皿/96 孔 UV 板后充分混匀,于 256nm 处测定初始吸光值 A1 和 3min 时的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。
A、 按微量石英比色皿计算:
1、按样本蛋白浓度计算
活性单位定义:25℃每毫克蛋白每分钟水解 1μmol BTEE 为一个酶活单位。糜蛋白酶活(U/mg prot)=(ΔA×V 反总÷ε÷d) ÷(Cpr×V 样)÷T=3.8×ΔA÷Cpr
2、 按样本质量计算
活性单位定义:25℃每克样本每分钟水解 1μmol BTEE 为一个酶活单位。糜蛋白酶活(U/g 质量)= (ΔA×V 反总÷ε÷d) ÷(W×V 样÷V 提取)÷T=3.8×ΔA÷W
3、 按血清(浆)体积计算
活性单位定义:25℃每毫升血清(浆)每分钟水解 1μmol BTEE 为一个酶活单位。糜蛋白酶活(U/mL )=(ΔA×V 反总÷ε÷d)÷V 样÷T=3.8×ΔA
V 样:加入反应体系中粗酶液体积,0.02mL;Cpr:粗酶液蛋白浓度,mg/mL,需要另外测定;W:样本质量,g;V反总:反应总体积,0.22mL;V 提取:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,3min;ε:BTEE 消光系数, 0.964mL/μmol/cm;d:比色皿光径,1cm。
将上述计算公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm(96 孔板光径)进行计算即可。
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