滤纸酶(FPA)活性检测试剂盒-滤纸酶(FPA)试剂盒-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-4228 规格:50T/24S 可见分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

试剂一

液体 35 mL×1

2-8℃保存

试剂二

液体 60 mL×1

2-8℃保存

滤纸条

50 mg×50

常温保存

标准品

粉剂×1

2-8℃保存

溶液的配制:

1. 滤纸条:常温防潮保存。

2. 标准品:10mg 无水葡萄糖。临用前加入 1 mL 蒸馏水溶解,配成 10 mg/mL 葡萄糖溶液备用,2-8℃保存两周。

产品说明:

               纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖一类酶的总称,它不是单体酶,而是起协同作用的多组分酶系。以不溶性纤维素如滤纸为底物测定的纤维素酶称为滤纸酶,研究滤纸酶活力对纤维素酶总体酶活力的研究的有着重要意义。FPA 水解滤纸产生还原糖,还原糖与 3,5 -二硝基水杨酸反应生成在 540 nm 有特征吸收峰的棕红色物质,通过测定 540 nm 处吸光值变化可计算得 FPA 活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。


需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅、1 mL 玻璃比色皿、超声破碎仪、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管(2 mL)。


操作步骤

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1. 组织:按照质量(g)﹕蒸馏水体积(mL) 1﹕5~10 的比例(建议称取约 0.1 g,加入 1 mL 蒸馏水)加入蒸馏水,冰浴匀浆后于 4℃,12000 rpm 离心 10 min,取上清置于冰上待测。

2. 细胞或细菌:先收集细胞或细菌到离心管中,离心后弃上清;按照细胞或细菌数量(104 个)﹕蒸馏水体积(mL 500~1000﹕1 的比例(建议 500 万细胞或细菌加入 1 mL 蒸馏水),冰浴超声波破碎细胞或细菌(功率 300 w 超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3 min);然后 4℃,12000 rpm 离心 10 min,取上清置于冰上待测。

3. 培养液或其它液体:直接检测。(若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定

二、测定步骤

1 分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 540 nm,蒸馏水调零。

2 10 mg/mL 标准液用蒸馏水稀释为 0.8、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2 mg/mL 的标准溶液备用。

3 标准品稀释表

序号

稀释前浓度(mg/mL)

标准液体积(µL)

蒸馏水体积(µL)

稀释后浓度(mg/mL)

1

10

200

1800

    1

2

1

400

100

0.8

3

1

300

200

0.6

4

1

250

250

0.5

5

1

200

300

0.4

6

1

150

350

0.3

7

1

100

400

0.2

  实验中每个标准管需200µL标准溶液。

4、 取 200 μL 样本沸水浴 10 min(盖紧,防止水分散失),放置常温后作为对照管。

5、操作表:( 2 mL 离心管中操作,其中对照管与测定管用有滤纸的 EP 管,空白管与标准管无需滤纸)

试剂名称(µL)

对照管

测定管

标准管

空白管

煮沸样本

200

-

-

-

样本

-

200

-

-

每支EP 管中放入一个卷状滤纸条(注意要放入底部),作为底物。

-

-

标准溶液

-

-

200

-

蒸馏水

-

-

-

200

试剂一

500

500

500

500

混匀,50℃水浴锅中准确反应 30 min

-

 

试剂二

800

800

800

800

混匀,沸水浴 5 min(盖紧,防止水分散失),取出后立即冷却至室温,测定 540nm 处吸光值 A,分别记为 A 对照管、A 测定管、A 标准管、A 空白管。计算ΔA 测定=A 测定管-A 对照管,ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。

每个测定管需设一个对照管,标准曲线和空白管只需检测 1-2 次。

三、FPA 活性计算

1 标准曲线的绘制:

根据标准管的浓度(x,mg/mL)和吸光度ΔA标准(y,ΔA标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA测定(y,ΔA测定)带入公式计算样本浓度(x,mg/mL)。

2 FPA 活性的计算:

(1) 按蛋白浓度计算

酶活定义:每 mg 蛋白每分钟分解滤纸产生 1 mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。

FPA 酶活(U/mg prot)=x×V 提取÷(V 提取×Cpr )÷T =0.0333x÷Cpr

  (2) 按样本质量计算

酶活定义:每g 样品每分钟分解滤纸产生 1 mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。

FPA 酶活(U/g 质量)=x×V 提取÷W÷T =0.0333x÷W

 (3) 按照细胞或细菌数量计算

酶活定义:每 104 个细胞每分钟分解滤纸产生 1 mg


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