货号:UPLC-MS-4355 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4354 | 规格:50T/24S | 可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
试剂一 |
液体 120 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
液体 3 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
试剂四 |
液体 30μL×1 支 |
-20℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂三:临用前取 1 支加入 1.667 mL 蒸馏水溶解,用不完的试剂-20℃保存 1 周。
2、 试剂四:临用前根据样本数量将试剂四用无水乙醇稀释 10 倍后使用。
TrxR 是一种 NADPH 依赖的包含 FAD 结构域的二聚体硒酶,属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员,与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR 与 GR 活性类似,催化 GSSG 还原生成 GSH, 是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。
TrxR 催化 NADPH 还原 DTNB 生成TNB 和 NADP+,TNB 在 412nm 有特征吸收峰,但还原型谷胱甘肽与 DTNB同样能反应生成 TNB,因此本试剂盒利用 2-乙烯吡啶抑制样本中原有的还原型谷胱甘肽,通过测定 412nm 波长处TNB 的增加速率,即可计算 TrxR 活性。
需自备的仪器和用品:
低温离心机、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、蒸馏水、无水乙醇。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一) 进行冰浴匀浆。10000rpm,4℃离心 10min,取上清置冰上待检测。
2、细菌、细胞:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3s,间隔 7s,总时间 3min),然后 10000rpm,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
注:测定前将上清液与试剂四以50:1的体积比混匀(即取100μL上清液加入2μL试剂四混合)37℃水浴30min后至冰上。
活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每毫克蛋白每分钟生成 1nmol TNB 为一个酶活力单位。TrxR(U/mg prot)=(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d) ×109×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T=147×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷Cpr
(2) 按样本质量计算
活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每克样本每分钟生成 1nmol TNB 为一个酶活力单位。TrxR(U/g 质量)=(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d) ×109×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T=147×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W
(3) 按细胞数量计算
活性单位定义:在25℃或者37℃中,每104个细胞每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。TrxR(U/104 cell)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×109×V 反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T= 147×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷细胞数量
ε:TNB 在 412nm 处的摩尔消光系数,1.36 ×104L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应体系总体积, 200μL=2×10-4L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;W:样本质量,g;V 样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V 样总:提取液体积,1mL;T:反应时间,5min;细胞数量:以 104 为单位,万个;109: 单位换算系数,1mol=109 nmol。
b. 使用96 孔板测定的计算公式如下
(1) 按蛋白浓度计算
活性单位定义:在 25℃ 或者 37℃中,每毫克蛋白每分钟生成 1nmol TNB 为一个酶活力单位。TrxR(U/mg prot)=(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d) ×109×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T=245×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷Cpr
(2) 按样本质量计算
活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每克样本每分钟生成 1nmol TNB 为一个酶活力单位。TrxR(U/g 质量)=(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d) ×109×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T=245×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W
(3) 按细胞数量计算
活性单位定义:在25℃或者37℃中,每104个细胞每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。
TrxR(U/104 cell)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×109×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V样总)÷T= 245×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷细胞数量
ε:TNB 在 412nm 处的摩尔消光系数,1.36 ×104L/ mol/cm;d:96 孔板光径,0.6cm;V 反总:反应体系总体积,200μL=2×10-4L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;W :样本质量,g;V 样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V 样总:提取液体积,1mL;T:反应时间,5min;细胞数量:以 104 为单位, 万个;109:单位换算系数,1mol=109 nmol。
1、 哺乳动物组织及血液制品 TrxR 活力测定时,一般须用蒸馏水稀释 5 倍左右;测定过程操作须迅速。
2、 由于试剂一中含有一定浓度的蛋白(约 0.1mg/mL),所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
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