货号:UPLC-MS-4186 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4185 | 规格:50T/48S | 紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 110 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 18 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×1 瓶 |
-20℃保存 |
试剂三 |
液体 18 μL×1 支 |
4℃保存 |
试剂四 |
液体 62 μL×1 支 |
4℃保存 |
试剂五 |
粉剂×1 瓶 |
-20℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 15 mL 试剂一溶解。可溶解后分装-20℃保存,避免反复冻融。
2、 试剂三:液体置于试剂瓶内 EP 管内。临用前加入蒸馏水按体积比 1:120 稀释,现用现配。
3、 试剂四:液体置于试剂瓶内 EP 管内。临用前加入蒸馏水按体积比 7:250 稀释,现用现配。
4、 试剂五:粉剂置于试剂瓶内玻璃管内。临用前加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解;可溶解后分装-20℃保存,避免反复冻融。
5、 工作液的配制:将试剂二、试剂三、试剂四按 7:1:1(V:V:V)的比例配制工作液,工作液现用现配。
PEPCK(EC 4.1.1.32)广泛存在于动物、开花植物、藻类、部分真菌和细菌中。该酶催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸,是调节糖异生途径的第一限速酶。
PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映PEPCK活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液) 进行冰浴匀浆,然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清,置冰上待测。
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
血清(浆)样本:直接检测。
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟。
3、 操作表:在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入下列试剂:
试剂名称 |
空白管 |
测定管 |
样本(µL) |
|
10 |
蒸馏水(µL) |
10 |
|
工作液(µL) |
180 |
180 |
试剂五(µL) |
10 |
10 |
加入试剂五后立即混匀,于 340nm 处测定 10s 时的吸光值 A1 和 1min10s 时的吸光值 A2,计算 ΔA测定管= A1 测定-A2 测定,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管(空白管只需做 1-2次)。 |
A 按微量石英比色皿计算:
1、 按蛋白浓度计算
酶活定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK酶活(U/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×Cpr)÷T= 3215.4×ΔA÷Cpr
2、 按样本质量计算
酶活定义:每g组织每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK酶活(U/g 质量)= ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T=3215.4×ΔA÷W
3、 按细菌或细胞数量计算
酶活定义:每104个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK酶活(U/104 cell)= ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T=6.43×ΔA
4、 按血清(浆)体积计算
酶活定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷V样÷T=3215.4×ΔA
ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,0.0002L;V 样:反应体系中样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g,T:反应时间:1min;500:细菌或细胞总数,500万;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
B 按96孔UV板计算:
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。
1、 当 A1 小于 1 或 ΔA 大于 0.6 时(96 孔 UV 板是当 A1 小于 0.6 或 ΔA 大于 0.4 时),建议将样本稀释适当倍数后再进行测定,以提高检测灵敏度。
2、 酶活性高的样本如动物肝、肾等组织,建议将提取液稀释 5 倍或 5 倍以上测定。
3、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过 0.06。
4、 加样、混匀等步骤要迅速,秒表计时要准确。
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