一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液） 进行冰浴匀浆，然后，8000g，4℃，离心 20min。

2、细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、 操作表：

在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分别加入上述试剂，充分混匀后于 340nm 处测定 10s 时的吸光值 A1，迅速置于 30℃水浴或培养箱 5min（酶标仪有控温功能的可将温度调至 30℃），拿出迅速擦干测定 310s 时的吸光值A2，计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。（空白管只需做 1-2 次）

三、PEPC酶活计算

1、 按微量石英比色皿计算：

          （1） 按蛋白浓度计算

酶活定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。PEPC 酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T=321×ΔA÷Cpr

（2） 按样本质量计算

酶活定义：每 g 组织在反应体系中每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。PEPC 酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T =321×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞数量计算

酶活定义：每 104 个细菌或细胞每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPC 酶活（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样÷V 样总×细胞数量（万个））÷T=321×ΔA÷细胞数量（万个）

ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/ mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，2×10-4L；V 样：反应体系中样本体积，0.02mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间：5min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

2、 按 96 孔 UV 板计算：

将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm（96 孔板光径）进行计算即可。

注意事项：

1、 为保证实验结果的准确性，需先取 1-2 个样做预实验，ΔA 大于 0.6 时，建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当 ΔA 小于 0.01 时，可以延长反应时间（10min 或 15min）来测定。

2、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.01。