上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 17 mL 试剂一和 1.13 mL 蒸馏水充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）水浴 5 分钟，用不完的试剂-20℃分装保存一周；

2、 试剂三：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据用量按照试剂三:蒸馏水为 1:50 的体积比例充分混匀， 现用现配；用不完的试剂三原液建议-20℃分装保存，避免反复冻融；

3、 试剂四：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据用量按照试剂四:蒸馏水为 1:125 的体积比例充分混匀， 现用现配。

产品说明：

PFK（EC 2.7.1.11）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和 ATP 转化为果糖二磷酸和 ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。PFK 催化果糖-6-磷酸和 ATP 生成果糖-二磷酸和 ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化 NADH 氧化生成 NAD+，在 340nm 下测定 NADH 下降速率，即可反映 PFK 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿或 96 孔板（UV）、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）提取液体积（mL）为 500-1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%或者 200W，超声 3s， 间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1:5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、 血清（浆）样本：直接检测。

二、测定步骤

1、紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定：在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 样本、10μL 试剂三、10μL 试剂四和 170μL 试剂二，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1，比色后迅速将比色皿或 96 孔板连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴或恒温箱中，准确反应 10 分钟；迅速取出比色皿并擦干，340 nm 下比色，记录 10 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A1-A2。

三、PFK 活力单位的计算

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1、血清（浆）PFK 活力的计算：

单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。PFK（U/mL）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109] ÷V 样÷T=321×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 PFK 活力的计算：

          （1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109] ÷(Cpr×V 样)÷T=321×ΔA÷Cpr

（2） 按样本质量计算

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK（U/g 质量）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T=321×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK（U/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109] ÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.642×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

b.  用96 孔板测定的计算公式如下：

1、血清（浆）PFK 活力的计算：

单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。PFK（U/mL）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109] ÷V 样÷T=535×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 PFK 活力的计算：

          （1） 按样本蛋白浓度计算