货号:UPLC-MS-4196 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4195 | 规格:50T/48S | 紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 100 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 20 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×1 瓶 |
-20℃保存 |
试剂三 |
液体 25μL×1 瓶 |
-20℃保存 |
试剂四 |
液体 10μL×1 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 17 mL 试剂一和 1.13 mL 蒸馏水充分溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其他物种)水浴 5 分钟,用不完的试剂-20℃分装保存一周;
2、 试剂三:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据用量按照试剂三:蒸馏水为 1:50 的体积比例充分混匀, 现用现配;用不完的试剂三原液建议-20℃分装保存,避免反复冻融;
3、 试剂四:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据用量按照试剂四:蒸馏水为 1:125 的体积比例充分混匀, 现用现配。
PFK(EC 2.7.1.11)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,负责将果糖-6-磷酸和 ATP 转化为果糖二磷酸和 ADP,是糖酵解过程的关键调节酶之一。PFK 催化果糖-6-磷酸和 ATP 生成果糖-二磷酸和 ADP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化 NADH 氧化生成 NAD+,在 340nm 下测定 NADH 下降速率,即可反映 PFK 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿或 96 孔板(UV)、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
1、 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个)提取液体积(mL)为 500-1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或者 200W,超声 3s, 间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5-10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3、 血清(浆)样本:直接检测。
1、紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、样本测定:在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 样本、10μL 试剂三、10μL 试剂四和 170μL 试剂二,混匀,立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1,比色后迅速将比色皿或 96 孔板连同反应液一起放入 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴或恒温箱中,准确反应 10 分钟;迅速取出比色皿并擦干,340 nm 下比色,记录 10 分 20 秒时的吸光度 A2,计算 ΔA=A1-A2。
1、血清(浆)PFK 活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。PFK(U/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109] ÷V 样÷T=321×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 PFK 活力的计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
PFK(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109] ÷(Cpr×V 样)÷T=321×ΔA÷Cpr
(2) 按样本质量计算
单位的定义:每 g 组织在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
PFK(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T=321×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
PFK(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109] ÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.642×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
b. 用96 孔板测定的计算公式如下:
1、血清(浆)PFK 活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。PFK(U/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109] ÷V 样÷T=535×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 PFK 活力的计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
PFK(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109] ÷(Cpr×V 样)÷T=535×ΔA÷Cpr
(2) 按样本质量计算
单位的定义:每 g 组织在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
PFK(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T=535×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞数量计算
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
PFK(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109] ÷(500×V 样÷V 样总)÷T=1.07×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:96 孔板光径,0.6cm;V 样:加入样本体积,0.01mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万;109,单位换算系数,1mol=109nmol。
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