| 货号：UPLC-MS-4455 | 规格：100T/96S | 微量法 |
| 货号：UPLC-MS-4454 | 规格：50T/48S | 紫外分光光度法 |
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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提取液 |
液体 100 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂一 |
液体 20 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂二 |
粉剂×2 瓶 |
2-8℃保存 |
溶液的配制：
试剂二：临用前取 1 瓶加入 2.8 mL 蒸馏水和 11 μL 浓 HCl 充分溶解待用。现配现用。2-8℃保存 4 周。
酪氨酸解氨酶（TAL）广泛存在于植物和微生物中，是苯丙氨酸次生代谢途径的关键酶之一。TAL能够跃过肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）直接将酪氨酸转化为香豆酸，香豆酸可进一步生成白藜芦醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素类天然产物。
TAL能够分解酪氨酸产生香豆酸，其在310nm下有吸收峰，根据吸光度的变化率可计算出TAL活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研 钵/匀浆器、细胞超声破碎仪、冰、浓盐酸和蒸馏水。
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、细胞或细菌：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 200w，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。12000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，波长调至310nm，紫外分光光度计蒸馏水调零。
2、 加样表（在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入）
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试剂一 |
140 |
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试剂二 |
40 |
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样本 |
20 |
将上述试剂分别加入微量石英比色皿/96 孔 UV 板后迅速吹打混匀，记录第 10s 的吸光值 A1，迅速置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）水浴或培养箱中 3min，拿出迅速擦干测定 3min10s 时的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。
A、按微量石英比色皿计算：
1、按蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟在310nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活性单位。
TAL（U/mg prot）=ΔA÷0.01×V反总÷(V样×Cpr)÷T =333×ΔA÷Cpr 2、按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟在310nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活性单位。
TAL（U/g 质量）=ΔA÷0.01×V反总÷(W÷V提取×V样)÷T =333×ΔA÷W
3、按细胞或细菌数量计算：
单位的定义：每104个细胞或细菌在反应体系中每分钟在310nm下吸光度变化0.01定义为一个酶活性单位。
TSL（U/104 cell）=ΔA÷0.01×V反总÷(500÷V提取×V样)÷T =0.667×ΔA
V反总：反应总体积，0.2mL；V样：加入的样本体积，0.02mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量， g；V提取：提取液体积，1mL；500：500万个细胞；T：反应时间，3min。
1、按蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟在310nm下吸光值变化0.005定义为一个酶活性单位。
TAL（U/mg prot）=ΔA÷0.005×V反总÷(V样×Cpr)÷T=667×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟在310nm下吸光值变化0.005定义为一个酶活性单位。
TAL（U/g 质量）=ΔA÷0.005×V反总÷(W÷V提取×V样)÷T=667×ΔA÷W
3、按细胞或细菌个数计算：
单位的定义：每104个细胞或细菌在反应体系中每分钟在310nm下吸光度变化0.005定义为一个酶活性单位。
TAL（U/104 cell）=ΔA÷0.005×V反总÷(500÷V提取×V样)÷T=1.334×ΔA
V反总：反应总体积，0.2mL；V样：加入的样本体积，0.02mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量， g；V提取：提取液体积，1mL；500：500万个细胞；T：反应时间，3min。
当ΔA大于0.2或者A1大于1.5时，建议将样本用蒸馏水稀释后测量；ΔA过小时，建议增加酶促反应时间（5min 或10min）或增加加入的样本体积来测定。（计算时注意同步修改计算公式）
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