| 货号：UPLC-MS-4381 | 规格：100T/96S | 微量法 |
| 货号：UPLC-MS-4380 | 规格：50T/48S | 紫外分光光度法 |
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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提取液 |
液体 110 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
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试剂一 |
液体 20 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
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试剂二 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前加入 10 mL 蒸馏水充分溶解。
AAO是定位于植物细胞壁的糖蛋白，属“蓝铜氧化酶”家族。细胞壁内的抗坏血酸和AAO与细胞壁的代谢和生长有着密切的联系。AAO氧化AsA所形成的MDHA可通过质膜上的细胞色素b还原，该过程中电子的跨膜运输能够促进细胞生长。
AAO可直接氧化AsA，通过测定AsA的氧化量，可计算得AAO活力。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可调式移液器、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
称取约 0.1g 样本，加提取液 1mL，冰上充分研磨，11000g 4℃离心 20min，取上清液待测。
1、 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到265nm，蒸馏水调零。
2、 试剂一在25℃水浴锅中预热30min。
3、 按下表依次在微量石英比色皿/96孔板中加入试剂
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试剂名称（μL） |
空白管 |
测定管 |
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蒸馏水 |
20 |
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上清液 |
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20 |
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试剂一 |
170 |
170 |
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试剂二 |
10 |
10 |
迅速混匀后在 265nm 测定 10s 和 130s 的吸光值，分别为 A1、A2，用 A1 减 A2，得到 ΔA 空白管、ΔA 测定管。
AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1个酶活单位。AAO(U/mg prot) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.0923×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷Cpr
（2） 按样本质量计算
AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1μmol AsA为1个酶活单位。AAO(U/g 质量) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×106÷(V样÷V样总×W)÷T=0.0923×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷W
ε：AsA在265nm处消光系数，5.42×104L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4L； 106：单位换算系数，1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W：样本质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：催化反应时间，2min。
b. 使用96孔板测定的计算公式如下
（1） 按蛋白浓度计算
AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1个酶活单位。AAO(U/mg prot) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.1538×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷Cpr
（2） 按样本质量计算
AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1μmol AsA为1个酶活单位。AAO(U/ g 质量) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×106÷(V样÷V样总×W)÷T=0.1538×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷W
ε：AsA在265nm处消光系数，5.42×104L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4L；106：单位换算系数，1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W：样本质量，g；V
样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：催化反应时间，2min。
由于试剂一中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
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