货号:UPLC-MS-4385 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4384 | 规格:50T/48S | 紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
试剂一 |
液体 120 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×2 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
液体 0.25mL×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加 10 mL 蒸馏水充分溶解。4℃可以保存 1 周。(由于试剂稳定性较差,故多给一瓶)
2、 试剂三:临用前根据样本量取适量试剂三用蒸馏水稀释 100 倍使用即可。
APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一,也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX 具有多种同功酶,分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体,以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化 H2O2 氧化 AsA, 是植物 AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到 AsA 的含量,APX 与 AsA 具有一定的负相关性。
APX 催化 H2O2 氧化 AsA,通过测定 AsA 氧化速率,来计算得 APX 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、低温离心机、移液枪、水浴锅、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
活性单位定义:每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol AsA 为 1 个酶活单位。APX(U/mg prot) = (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106÷(Cpr×V 样)÷T=1.79×(ΔA 测定管-ΔA 空白管) ÷Cpr
(2) 按样本质量计算
活性单位定义:每克样本每分钟氧化 1μmol AsA 为 1 个酶活单位。
APX(U/g 质量) = (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106÷(V 样÷V 样总×W)÷T=1.79×(ΔA 测定管-ΔA 空白管) ÷W
ε:AsA 在 290nm 处摩尔吸光系数为 2.8×103 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应体系总体积, 200μL=2×10-4L;106:单位换算系数,1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;W:样本质量,g;V 样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V 样总:加入试剂一体积,1mL;T:催化反应时间,2min。
b. 使用96 孔板测定的计算公式如下
(1) 按蛋白浓度计算
活性单位定义:每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol AsA 为 1 个酶活单位。
APX(U/mg prot) = (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106÷(Cpr×V 样)÷T=3×(ΔA 测定管-ΔA 空白管) ÷Cpr
(2) 按样本质量计算
活性单位定义:每克样本每分钟氧化 1μmol AsA 为 1 个酶活单位。
APX(U/g 质量) = (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106÷(V 样÷V 样总×W)÷T=3×(ΔA 测定管-ΔA 空白管) ÷W
ε:AsA 在 290m 处摩尔吸光系数为 2.8×103 L/mol/cm;d:96 孔板光径,0.6cm;V 反总:反应体系总体积, 200μL=2×10-4L;106:单位换算系数,1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;W:样本质量,g;V 样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V 样总:加入试剂一体积,1mL;T:催化反应时间,2min。
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