二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到265nm，蒸馏水调零。

2、 试剂二在25℃水浴锅中预热30min以上。

3、 标准管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL标准液、160μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后于265nm测定，记录30s和150s的吸光值A1和A2。ΔA标准管=A1-A2。

4、 测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后于265nm测定，记录30s和150s的吸光值A3和A4。ΔA测定管=A3-A4。

注意：如果样本数量较大。可将试剂二与试剂三按照8:1的体积比混匀配成工作液使用，根据样本所需现配现用，禁止一次性配完。加样顺序为180 μL工作液、20 μL上清液（或标准液），加入上清液（或标准液）即开始计时。（标准管只需测定1-2次）

三、AsA 含量计算公式

1、 按蛋白浓度计算：

AsA (nmol/mg prot) =（C标准液×ΔA测定管÷ΔA标准管×V样）÷（Cpr×V样）=400×ΔA测定管÷ΔA标准管÷Cpr 2、 按样本质量计算：

AsA(nmol/g  质量) =（C标准液×ΔA测定管÷ΔA标准管×V样）÷(W×V样÷V样总) =400×ΔA测定管÷ΔA标准管÷W 3、 按细胞数量计算：

AsA(nmol/104 cell) =（C标准液×ΔA测定管÷ΔA标准管×V样）÷(细胞数量×V样÷V样总)=400×ΔA测定管÷ΔA标准管÷细胞数量4、 按液体体积计算：

AsA (nmol/mL) =（C标准液×ΔA测定管÷ΔA标准管×V样）÷V样=400×ΔA测定管÷ΔA标准管

C标准液：标准液的浓度，400μmol/L=400nmol/mL；V样总：上清液总体积，1.0mL；V样：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；细胞数量：以104为单位计量，万。

注意事项：

1、 试剂三和标准品现配现用，配制好的 4℃保存，3 天内使用完。

2、 如果样本初始吸光值大于 1.4，建议将样本用试剂一稀释后进行测定。