上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂四：临用前每支加入 5 mL 试剂一。

2、 试剂五：临用前每支加入 10 mL 试剂一。

3、 试剂六：临用前取 1 支加入 208 μL 双蒸水，充分溶解备用，用不完的试剂 4℃保存。

4、 试剂八：每支临用前加入溶解好的 4 mL 试剂四。5、 反应液Ⅰ的配制：临用前在试剂二中加入 14 mL 试剂一，缓慢加热，逐渐升温至水沸腾使其溶解，冷却后加入试剂三混合溶解，这样可以分两批配制并且测定。

产品说明：

GBSS（EC  2.4.1.21）以束缚态存在于淀粉体中，催化淀粉链的加长反应，主要负责直链淀粉的合成。GBSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成ADP；进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP+还原为NADPH，其中NADPH生成量与前一步反应生成的ADP数量呈正比，通过340nm下测定NADPH的增加量，可以计算GBSS活性。

注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

称取约 0.1g 组织加入 1mL 提取液，冰浴中匀浆。10000g ，4℃离心 10min，弃上清，在沉淀中加入 1mL 提取液充分混匀，置冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 在EP管中按顺序加入下列试剂

混匀后立即转移 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中，340nm 波长下记录初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。

注意：试剂二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混匀。

三、GBSS活性计算

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。GBSS活性（U/mg prot）=[ΔA÷（ε×d）×V测]÷(Cpr×V样÷V反总×V上清) ÷T=43.2×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本质量计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。GBSS活性（U/g 质量）=[ΔA÷（ε×d）×V测]÷(W÷V提取×V样÷V反总×V上清) ÷T=43.2×ΔA÷W

V测：测量体积，0.26mL；V样：加入样本体积，0.1mL；V反总：反应体积，0.31mL；V上清：加入上清液体积，0.15mL；V提取：加入提取液体积，1mL；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10-3mL/nmol/cm；d：比色皿光径，1cm；T：反应时间，20min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

b. 使用96孔板测定的计算公式如下：

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。GBSS活性（U/mg prot）=[ΔA÷（ε×d）×V测]÷(Cpr×V样÷V反总×V上清) ÷T=72×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。