上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入 18 mL 试剂一充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min； 用不完的试剂 4℃保存一周；

2. 试剂三：临用前取 1 支加入 0.5 mL 试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂 4℃保存一周。

产品说明：

HK（EC 2.7.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶，催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。

HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板（UV板）、研钵/匀浆器、冰。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

血清（浆）样本：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 在微量石英比色皿或96孔板中加入180μL试剂二、10μL试剂三和10μL样本，混匀，立即记录340nm处20秒时的吸光值A1，比色后迅速将比色皿或酶标板连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴或恒温箱中，准确反应5分钟；迅速取出比色皿并擦干，340nm下比色，记录5分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。

三、HK 活性计算

A、用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 血清（浆）HK活性

单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

HK（U/mL）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=643×ΔA

2. 组织、细菌或细胞中HK活性

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

HK（U/mg prot）=[ΔA×V  反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2） 按样本质量计算

单位的定义：每g 组织每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

HK（U/g 质量）=[ΔA×V  反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=643×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

HK（U/104 cell）=[ΔA×V  反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.286×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

B、用96 孔板测定的计算公式如下

1. 血清（浆）HK活性

单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

HK（U/mL）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=1071.7×ΔA

2. 组织、细菌或细胞中HK活性

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

HK（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1071.7×ΔA÷Cpr

（2） 按样本质量计算

单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

HK（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=1071.7×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

HK（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=2.143×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V 样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。