货号:UPLC-MS-6020 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-6019 | 规格:50T/24S |
可见分光光度法 |
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液一 |
液体 60 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
提取液二 |
液体 8 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
试剂二 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
试剂三 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
试剂四 |
粉剂×1 支 |
4℃保存 |
试剂五 |
粉剂×2 瓶 |
-20℃保存 |
试剂六 A 液 |
液体 10 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂六 B 液 |
液体 10 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
标准品 |
粉剂×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1. 试剂一:临用前每支加入 1.7 mL 蒸馏水,充分溶解。用不完的试剂-20℃分装保存两周。
2. 试剂二:临用前每支加入 1.65 mL 蒸馏水,充分溶解。用不完的试剂-20℃分装保存两周。
3. 试剂三:临用前每支加入 1 mL 蒸馏水(50T/48S),充分溶解。为方便储存故多给一支。用不完的试剂-20℃分装保存两周。
4. 试剂三工作液:根据试验所需用量,按照试剂三:蒸馏水=1:9 的比例,充分混匀,现配现用。
5. 试剂四:临用前加入 1 mL 蒸馏水,充分溶解。用不完的试剂-20℃分装保存两个月。
6. 试剂五:临用前每瓶加入 3.4 mL 蒸馏水,充分溶解。用不完的试剂-20℃分装保存两周。
7. 试剂六:临用前根据实验所需用量,按照试剂六 A 液:试剂六 B 液=1:1 的比例,充分混匀,现用现配。
8. 标准品:1 mg 肌酐。临用前加入 1 mL 蒸馏水,充分溶解,即 1 mg/mL 标准储备液,4℃保存 1 个月。临用前取 50μL 和 200μL 蒸馏水混合配制成 200μg/mL 的标准溶液备用,现用现配。
产品说明:
肌酐(creatinine,Cr),化学式是 C4H7N3O,是肌肉在人体内代谢的产物,主要由肾小球滤过排出体外。血中肌酐来自外源性和内源性两种,外源性肌酐是肉类食物在体内代谢后的产物;内源性肌酐是体内肌肉组织代谢的产物。
肌酐在肌酸酶的催化下肌酸水解生成肌氨酸和尿素,肌氨酸在肌氨酸氧化酶的催化下氧化产生过氧化氢。过氧化物酶催化过氧化氢氧化 4-氨基安替比林偶联酚,生成有色化合物,在 505nm 有特征吸收峰。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、超声破碎仪。
操作步骤:
1、细菌、细胞样本的制备:按照细胞数量(104 个):提取液一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入1mL 提取液一),冰浴超声波破碎细胞(功率300W,超声3 秒,间隔9 秒,总时间5 min);于4℃,12000g离心 10 min,取 0.8 mL 上清液,再加入 0.15 mL 提取液二,混匀,4℃,12000 g 离心 10 min 后取上清待测。
2、组织样本的制备:按照质量(g):提取液一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1 g 组织,加入 1mL 提取液一)加入提取液一,冰浴匀浆后于 4℃,12000 g 离心 10 min,取 0.8 mL 上清液,再加入 0.15 mL 提取液二, 混匀,4℃,12000 g 离心 10 min 后取上清待测。
3、血清(浆):取 100 μL 血清(浆)加入 1 mL 提取液一,4℃,12000 g 离心 10 min,取 0.8 mL 上清液,再加入 0.15 mL 提取液二,混匀,4℃,12000 g 离心 10 min 后取上清待测。
1、 分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 505 nm,蒸馏水调零。
2、 按步骤加样
1、 计算公式
(1) 按照蛋白浓度计算
肌酐含量(μg/mg prot)= C 标×ΔA 测÷ΔA 标×V 样÷(V 样×Cpr)=200×ΔA 测÷ΔA 标÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
肌酐含量(μg/g 质量)= C 标×ΔA 测÷ΔA 标×(V 上清+V 提取液二)÷(W×V 上清÷V 提取液一)= 237.5×ΔA 测÷ΔA 标÷W
(3) 按照细菌或细胞数量计算
肌酐含量(μg/104 cell)= C 标×ΔA 测÷ΔA 标×(V 上清+V 提取液二)÷(细胞数量×V 上清÷V 提取液一)= 237.5×ΔA 测÷ΔA 标÷细胞数量
(4) 按照血清(浆)体积计算
肌酐含量(μg/mL)= C 标×ΔA 测÷ΔA 标×(V 上清+V 提取液二)÷ [V 液体×V 上清÷(V 提取液一+V 液体)]= 2612.5×ΔA 测÷ΔA 标
C 标:标准管浓度,200 μg/mL;V 样:加入样本体积,20 μL=0.02mL;V 上清:提取时上清液体积,0.8 mL;V 提取液一:加入提取液一体积,1 mL;V 提取液二:加入提取液二体积,0.15 mL;W:样本质量,g;Cpr: 样本蛋白浓度,mg/mL;细胞数量:以 104 计;V 液体:液体样本体积,0.1 mL。
注意事项:
1、提取液中含有蛋白沉淀剂,提取的上清液不能用于蛋白浓度的测定。若想要用蛋白浓度计算肌酐含量需要另取样本,即取相同质量的组织、同等数目的细菌或细胞,用 1.1875mLPBS(生理盐水)匀浆;取相同体积的血清(浆),用 1.206mLPBS(生理盐水)匀浆(相当于提取步骤最终样本上清液),用 BCA 法进行蛋白浓度测定。
2、如果测定吸光值超过标准管吸光值,建议用蒸馏水稀释样本后再进行测定。如果 ΔA 测定小于 0.01,建议增大样本量后再进行测定。
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