溶液的配制：

1、标准品：10 mg 海藻糖。临用前加 1 mL 蒸馏水，溶液浓度为 10 mg/mL，2-8℃保存两周；

2、工作液的配制：临用前取 1 瓶试剂一中加入 8 mL 蒸馏水后，缓慢加入 32 mL 浓硫酸，不断搅拌，充分溶解，待用。用不完的试剂 2-8℃保存一周，试剂颜色变深后则不可以再使用。

产品说明：

海藻糖存在于大量有机体中，包括细菌、藻类、酵母、植物、昆虫和其他无脊椎动物。由于海藻糖具有独特的不同于其他碳水化合物的生物学特性，能在干旱、高温、脱水、冷冻、高渗透压及毒性物质等恶劣环境下保护生物体细胞蛋白质、脂肪、糖类、核酸等组分不受损害。

测定方法采用蒽酮比色法。具有灵敏度高﹑简便快捷﹑适用于微量样本的测定等优点。但是蒽酮比色法也存在一定缺陷，如果样本中含有可溶性糖，则会影响测定。本试剂盒建议用于除海藻糖外不含其他可溶性糖样本的测定。

技术指标：

最低检出限：0.0016 mg/mL

线性范围：0.003125-0.1 mg/mL

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液， 超声波破碎细菌或细胞（功率 200w，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），室温静置 45min，振荡 3~5 次， 冷却后，8000g，常温离心 10min，取上清。

2、 组织的处理：称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆或研碎，室温静置 45min，振荡 3~5 次，冷却后，8000g，常温离心 10min，取上清。

3、 血清（浆）的处理：吸取约 100μL 血清（浆），加入 0.9mL 提取液，充分混匀，室温静置 45min，振荡 3~5次，冷却后，8000g，常温离心 10min，取上清。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 620nm，蒸馏水调零。

2、 调节水浴锅至 95℃。

3、 标准品的准备：将标准品用蒸馏水稀释到 0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0mg/mL。

4、 标准品稀释表

实验中每个标准管需 0.25mL 标准溶液。

5、 标准曲线的建立：取 0.25mL 标准液和 1mL 工作液至 EP 管中，95℃水浴 10min（盖紧，防止水分散失），自然冷却至室温，取 1mL 至比色皿中，在 620nm 处测吸光值 A。ΔA 标准=A 标准-A 空白，根据标准管的浓度

（x，mg/mL）和吸光度 ΔA 标准（y，ΔA 标准），建立标准曲线。

6、 样本测定：取 0.25mL 样本和 1mL 工作液至 EP 管中，95℃水浴 10min（盖紧，防止水分散失），自然冷却至室温，取 1mL 至比色皿中，在 620nm 处测吸光值A。

三、海藻糖含量计算

1、 根据标准曲线，将 ΔA 测定（y， A 测定）带入公式计算样本浓度（x，mg/mL）。

2、 按样本质量计算：

海藻糖含量(mg/g 质量)= V1×x÷(W×V1÷V2)=x ÷W 3、 按样本蛋白浓度计算：

海藻糖含量(mg/mg prot)=V1×x÷(V1×Cpr)=x÷Cpr 4、 按细菌或细胞数量计算：

海藻糖含量(μg/104 cell)=（1000×V1×x ）÷(500 ×V1÷V2) =2x 5、 按血清（浆）体积含量计算：

海藻糖含量（mg/mL）＝(V1×x)÷(V3×V1÷ V2)=10x

1000：单位换算系数，1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入反应体系中样本体积，0.25mL；V2：提取液总体积，

1mL；V3：加入血清（浆）体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

注意事项：