海藻糖合成酶(TS)活性检测试剂盒-海藻糖合成酶(TS)试剂盒-上海液质




上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-5022 规格:100T/48S 微量法
货号:UPLC-MS-5021 规格:50T/24S 可见分光光度法


产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 30 mL×1

4℃保存

试剂一

液体 7mL×1

4℃保存

试剂二

粉剂×1

4℃保存

试剂三

液体 30 mL×1

4℃保存

试剂四

液体 30 mL×1

4℃保存

标准品

粉剂×1

4℃保存

溶液的配制:

1 试剂二:临用前先加入 14 mL 蒸馏水,震荡使其充分溶解(若溶解后的试剂中有黑色颗粒物,可离心后取上清使用),用不完的试剂 4℃保存 2 周。

2 工作液的配制:临用前将试剂三和试剂四 1:1 等体积混合,根据样本实际所需用量现配现用。

3 标准品:临用前加入 1 mL 蒸馏水配制成 50 μmol/mL 的麦芽糖标准溶液,用不完的试剂 4℃保存 2 周。然后用蒸馏水 16 倍稀释成 3.125 μmol/mL 的麦芽糖标准溶液(建议吸取 25μL 50μmol/mL 麦芽糖标准溶液,加入 375μL 蒸馏水中,充分混匀)待测。

产品说明:

海藻糖是功能性低聚糖,具有非还原性、保湿性、热酸稳定性、抗冻结性等特性,是细胞在不良环境条件下产生的一种重要的抗逆应激物之一,它对生物大分子和生物组织有着非特异性的保护作用。

海藻糖合成酶(Trehalose Synthase,TS)能催化麦芽糖生成海藻糖,是海藻糖生物合成的关键途径之一。本试剂盒使用糖化酶分解剩余麦芽糖为葡萄糖,通过葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量,按照麦芽糖减少的量表示海藻糖合成酶的活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、低温离心机、恒温水浴锅、可调式移液枪、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每500万细菌或细胞加入1 mL提取液, 超声波破碎细胞(功率200W,超声3s,间隔9s,重复30次);然后8000 g,4℃,离心10 min,取上清(若上清不够澄清,建议重复上述离心步骤),置于冰上待检。

组织:按照组织质量(g): 提取液体积(mL)为1 : 5~10 的比例(建议称取约0.1 g组织,加入1 mL提取液), 进行冰浴匀浆。8000 g,4℃,离心10 min,取上清(若上清不够澄清,建议重复上述离心步骤,置于冰上待检。

二、测定步骤

1 分光光度计预热30 min以上,调节波长至505 nm,蒸馏水调零。

2 EP管中进行如下操作:

(1) 酶促反应

加入试剂(μL

对照管

测定管

标准管

空白管

样本

100

100

-

-

试剂一

-

100

-

-

标准溶液

-

-

100

-

蒸馏水

-

-

100

200

充分混匀,35℃水浴反应2 h,沸水浴5 min终止反应,冷却至室温。

-

-

试剂一

100

-

-

-

试剂二

200

200

200

200

混匀,40℃过夜反应12 h以上,沸水浴5 min终止反应,冷却至室温。10000 g 25℃离心10 min

取上清待测。

(2) 显色反应(在EP 管中进行以下操作)

加入试剂(μL

对照管

测定管

标准管

空白管

上清液

100

100

100

100

工作液

900

900

900

900

充分混匀,37℃反应30 min,于1 mL玻璃比色皿中测定505 nm处的吸光值,分别记为A对照、A定、A标准与A空白,ΔA测定=A对照-A测定、ΔA标准=A标准-A空白。

注:空白管和标准管只需测 1~2 次

三、酶活性计算

1、按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化1 nmol 麦芽糖生成1 nmol  海藻糖定义为一个酶活力单位。

TS酶活(U/mg prot)= C标×ΔA测定÷ΔA标准×V样÷(V样×Cpr )÷T×F÷2

=13.02×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr×F

2、按样本质量计算:

单位的定义:每g组织每分钟催化1 nmol 麦芽糖生成1 nmol 海藻糖定义为一个酶活力单位。

TS酶活(U/g 质量)= C标×ΔA测定÷ΔA标准×V样÷(V样÷V 样总×W)÷T×F÷2

=13.02×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F

3、按细菌或细胞数量计算:

单位的定义:每104个细菌或细胞每分钟催化1 nmol 麦芽糖生成1 nmol 海藻糖定义为一个酶活力单位。

TS酶活(U/104 cell)= C标×ΔA测定÷ΔA标准×V样÷(V样÷V 样总×cell )÷T×F÷2

=13.02×ΔA测定÷ΔA标准÷cell×F

 C标:标准管浓度,3.125 μmol/mL=3.125×10 3 nmol/mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;V样:加入样本体积,0.1 mL;T:反应时间,120 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;cell:细胞或细菌总数, 以万计;F:稀释倍数; 2:1分子麦芽糖可转化为2分子葡萄糖。

注意事项:

1 当吸光值大于 1.5 或者 ΔA 测定大于 1 时,建议将样本用蒸馏水稀释后测量。计算公式注意乘以稀释倍数。



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