上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1、标准品：称1mg标准品用1mL蒸馏水溶解，浓度为1mg/mL。

产品说明：

谷胱甘肽是由谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（-SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和 5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’- dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生 2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为黄色产物，在波长 412nm 处具有最大光吸收。

技术指标：

最低检出限：3.763 μg/mL

线性范围：12.5-400 μg/mL

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

分析天平、匀浆器/研钵、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计或酶标仪、微量玻璃比色皿或 96孔板。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织处理：新鲜组织首先用 PBS 冲洗 2 次，然后称取动物组织或者植物组织 0.1g，加入用试剂一润洗过的匀浆器中（匀浆器提前放冰上预冷）；然后加入 1mL 试剂一（组织/试剂一比例保持不变即可），迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；8000rpm，4℃离心 10min；取上清液放置于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

2、血液处理

血浆：将收集的抗凝血于 4℃，600g 离心 10 分钟，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的试剂一，4℃，8000g 离心 10 分钟，将上清移入新的试管中放置于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。血细胞：将收集的抗凝血于 4℃，600g 离心 10 分钟，弃去上层血浆用 3 倍体积的 PBS 清洗 3 次（用 PBS 重悬血细胞，600g 离心 10 分钟），加入等体积试剂一，混匀后 4℃放置 10 分钟，8000g 离心 10 分钟，吸取上清放于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

3、细胞处理

收集不少于 500 万个细胞，首先用 PBS 清洗细胞 2 次（PBS 重悬细胞，600g 离心 10 分钟），加入 1mL 试剂一重悬细胞，反复冻融 2-3 次（可在液氮中冻结，37℃水浴中溶解）或者进行超声（200W，超 3s，停 10s，重复 30 次），8000g 离心 10 分钟，收集上清于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

二、测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。

2、试剂二放置 37℃（哺乳动物）或 25℃（一般物种）水浴中保温 30min。

3、空白管检测：取微量玻璃比色皿，依次加入 20μL 蒸馏水，140μL 试剂二，40μL 试剂三，混匀，放置 2min 后测定 412nm 吸光度 A1。

4、制作标准曲线

临用前根据实验所需量将试剂一用蒸馏水稀释十倍，作为标准品稀释液待用。

取适当标准溶液用标准品稀释液配制浓度为 300μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL 的标准品。取 1.5mL EP 管依次加入 20μL 标准品，140μL 试剂二，40μL 试剂三，每管混匀后静置 2min，检测 412nm 处吸光度，吸光度减去空白孔（A1）为横坐标，根据吸光度（x）和浓度（y，μg/mL）做出标准曲线。

5、样本管测定：取微量玻璃比色皿，依次加入 20μL 样本，140μL 试剂二，40μL 试剂三，混匀后静置 2min 检测 412nm处吸光度 A2，ΔA= A2- A1。

6、酶标仪操作同分光光度计，操作尽量迅速。

三、GSH含量计算

根据标准曲线，将样本 ΔA 带入公式中（x），计算出样本浓度 y（μg/mL）。

（1） 按蛋白浓度计算

GSH（μg/mg prot）=y×V 样÷（V 样×Cpr）=y÷Cpr

（2） 按样本质量计算

GSH（μg/g 质量）=y×V 样÷(V 样÷V 样总×W) =y÷W

（3） 按细胞数量计算

GSH（μg/106 cell）=y×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量) =y÷细胞数量

（4） 按血浆（血细胞）体积计算

GSH（μg/mL）=2y

V 样总：上清液总体积，1mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；W：样本质量，g；Cpr： 上清液蛋白质浓度，mg/mL；细胞数量：以 106 为单位计量；2：血浆（血细胞）体积被稀释一倍。

注意事项：

1、 样本处理需匀浆完全，若当天不能完成测量，可放-80℃保存。

2、 标准品：还原型谷胱甘肽现配现用。

3、 若不确定样本中 GSH 含量的高低，可稀释几个梯度后再进行测量。