货号:UPLC-MS-4487 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4486 | 规格:50T/24S |
可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
试剂一 |
液体 100 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
液体 20 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
液体 8 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
标准品 |
粉剂 10 mg×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、标准品:称1mg标准品用1mL蒸馏水溶解,浓度为1mg/mL。
谷胱甘肽是由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)组成的天然三肽,是一种含巯基(-SH)的化合物,广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和 5,5’-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)(5,5’- dithiobis-2-nitrobenoic acid,DTNB)反应产生 2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。2-硝基-5-巯基苯甲酸为黄色产物,在波长 412nm 处具有最大光吸收。
最低检出限:3.763 μg/mL
线性范围:12.5-400 μg/mL
需自备的仪器和用品:
分析天平、匀浆器/研钵、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计或酶标仪、微量玻璃比色皿或 96孔板。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织处理:新鲜组织首先用 PBS 冲洗 2 次,然后称取动物组织或者植物组织 0.1g,加入用试剂一润洗过的匀浆器中(匀浆器提前放冰上预冷);然后加入 1mL 试剂一(组织/试剂一比例保持不变即可),迅速冰上充分研磨(使用液氮研磨效果更好);8000rpm,4℃离心 10min;取上清液放置于 4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存 10 天)。
2、血液处理
血浆:将收集的抗凝血于 4℃,600g 离心 10 分钟,吸取上层血浆到另一支试管中,加入等体积的试剂一,4℃,8000g 离心 10 分钟,将上清移入新的试管中放置于 4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存 10 天)。血细胞:将收集的抗凝血于 4℃,600g 离心 10 分钟,弃去上层血浆用 3 倍体积的 PBS 清洗 3 次(用 PBS 重悬血细胞,600g 离心 10 分钟),加入等体积试剂一,混匀后 4℃放置 10 分钟,8000g 离心 10 分钟,吸取上清放于 4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存 10 天)。
3、细胞处理
收集不少于 500 万个细胞,首先用 PBS 清洗细胞 2 次(PBS 重悬细胞,600g 离心 10 分钟),加入 1mL 试剂一重悬细胞,反复冻融 2-3 次(可在液氮中冻结,37℃水浴中溶解)或者进行超声(200W,超 3s,停 10s,重复 30 次),8000g 离心 10 分钟,收集上清于 4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存 10 天)。
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 412nm,蒸馏水调零。
2、试剂二放置 37℃(哺乳动物)或 25℃(一般物种)水浴中保温 30min。
3、空白管检测:取微量玻璃比色皿,依次加入 20μL 蒸馏水,140μL 试剂二,40μL 试剂三,混匀,放置 2min 后测定 412nm 吸光度 A1。
4、制作标准曲线
临用前根据实验所需量将试剂一用蒸馏水稀释十倍,作为标准品稀释液待用。
取适当标准溶液用标准品稀释液配制浓度为 300μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL 的标准品。取 1.5mL EP 管依次加入 20μL 标准品,140μL 试剂二,40μL 试剂三,每管混匀后静置 2min,检测 412nm 处吸光度,吸光度减去空白孔(A1)为横坐标,根据吸光度(x)和浓度(y,μg/mL)做出标准曲线。
5、样本管测定:取微量玻璃比色皿,依次加入 20μL 样本,140μL 试剂二,40μL 试剂三,混匀后静置 2min 检测 412nm处吸光度 A2,ΔA= A2- A1。
6、酶标仪操作同分光光度计,操作尽量迅速。
根据标准曲线,将样本 ΔA 带入公式中(x),计算出样本浓度 y(μg/mL)。
(1) 按蛋白浓度计算
GSH(μg/mg prot)=y×V 样÷(V 样×Cpr)=y÷Cpr
(2) 按样本质量计算
GSH(μg/g 质量)=y×V 样÷(V 样÷V 样总×W) =y÷W
(3) 按细胞数量计算
GSH(μg/106 cell)=y×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量) =y÷细胞数量
(4) 按血浆(血细胞)体积计算
GSH(μg/mL)=2y
V 样总:上清液总体积,1mL;V 样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;W:样本质量,g;Cpr: 上清液蛋白质浓度,mg/mL;细胞数量:以 106 为单位计量;2:血浆(血细胞)体积被稀释一倍。
1、 样本处理需匀浆完全,若当天不能完成测量,可放-80℃保存。
2、 标准品:还原型谷胱甘肽现配现用。
3、 若不确定样本中 GSH 含量的高低,可稀释几个梯度后再进行测量。
4、 因为试剂一中含有蛋白质沉淀剂,因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量,需另取组织。
5、 如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
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