货号:UPLC-MS-4539 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4538 | 规格:50T/24S |
可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 110 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 20 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
液体 0.21 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
液体 3 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:液体置于试剂瓶内 EP 管中,使用前需先离心。取 0.1 mL 试剂二加入 1.5 mL 试剂一混合备用(约53T),现配现用,也可根据样本量按比例配制。
POD(EC 1.11.1.7)广泛存在于动物、植物、微生物中,可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物,具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。POD 在有过氧化氢存在的情况下,能使愈创木酚发生氧化,生成茶褐色物质,该物质在 470nm 有最大光吸收。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌、细胞或组织样本的制备
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴, 功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液), 进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样本:直接检测。
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 470nm,蒸馏水调零。
2、 测定前将试剂一、二和三在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)放置 10min 以上。
3、 样本测定表
试剂名称(µL) |
测定管 |
试剂一 |
120 |
试剂二 |
30 |
试剂三 |
30 |
蒸馏水 |
60 |
样本 |
5 |
在 EP 管中按顺序加入上述试剂,立即混匀并计时,立即取 200µL 转移至微量玻璃比色皿或 96 孔板中,记录470nm 下 30s 时的吸光值 A1 和 1min30s 后的吸光值 A2。计算 ΔA=A2-A1。
a、用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下
1、按血清(浆)体积计算
单位定义:每 mL 血清(浆)在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。POD(U/mL)=ΔA÷0.01×V 反总÷V 样÷T =4900×ΔA
2、按样本蛋白浓度计算
单位定义:每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。POD(U/mg prot)=ΔA÷0.01×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T =4900×ΔA÷Cpr
3、按样本质量计算
单位定义:每 g 组织在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。POD(U/g 质量)=ΔA÷0.01×V 反总÷(W÷V 样总×V 样)÷T =4900×ΔA÷W
4、按细菌或细胞数量计算
单位定义:每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。POD(U/104 cell)=ΔA÷0.01×V 反总÷(500÷V 样总×V 样)÷T =9.8×ΔA
1、按血清(浆)体积计算
单位定义:每 mL 血清(浆)在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。POD(U/mL)=ΔA÷0.005×V 反总÷V 样÷T =9800×ΔA
2、按样本蛋白浓度计算
单位定义:每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。POD(U/mg prot)=ΔA÷0.005×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T =9800×ΔA÷Cpr
3、按样本质量计算
单位定义:每 g 组织在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。POD(U/g 质量)=ΔA÷0.005×V 反总÷(W÷V 样总×V 样)÷T =9800×ΔA÷W
4、按细菌或细胞数量计算
单位定义:每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。POD(U/104 cell)=ΔA÷0.005×V 反总÷(500÷V 样总×V 样)÷T =19.6×ΔA
V 反总:反应体系总体积,0.245mL;V 样:加入样本体积,0.005mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T: 反应时间,1min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
1、 如一次测定的样本数量较多,可将试剂一、二、三和蒸馏水按照比例混合,在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)放置 10min,测定时加入 240μL 即可。
2、 样本测定值如果小于 0.005,可将反应时间延长到 3-5 分钟,计算时除以反应时间即可;如果高于 0.5 或者反应液中有较多气泡产生,可将样本用提取液进行稀释。计算时乘以相应的稀释倍数即可。
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