货号:UPLC-MS-4533 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4532 | 规格:50T/48S | 紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 110 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 30 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
液体 110 μL×1 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:液体置于试剂瓶内 EP 管中,使用前需先离心。
2、 检测工作液的配制:A. 使用 96 孔 UV 板:取试剂二 25 μL 中加入 5mL 试剂一,充分混匀,作为工作液(约 26T),现用现配; 也可根据样本量按比例配制(提供 1 个 15 mL 空瓶)。
B. 使用微量石英比色皿:取试剂二 25 μL 中加入 6.5mL 试剂一,充分混匀,作为工作液(约 34T),现用现配;也可根据样本量按比例配制(提供 1 个 15 mL 空瓶)。
CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是最主要的 H2O2 清除酶,在活性氧清除系统中具有重要作用。
H2O2 在 240nm 下有特征吸收峰,CAT 能够分解 H2O2,使反应溶液 240nm 下的吸光度随反应时间而下降,根据吸光度的变化率可计算出 CAT 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌、细胞或组织样本的制备:
a、细菌或培养细胞:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液, 超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
b、组织:按照组织质量(g):称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min, 取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样本:直接检测。
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 240nm,蒸馏水调零。
2、 测定前将 CAT 检测工作液在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。
3、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 工作液,立即混匀并计时,记录 240nm 下初始吸光值 A1
和 1min 后的吸光值 A2。计算 ΔA=A1-A2。
1、血清(浆)CAT 活力的计算:
单位的定义:每 mL 血清(浆)每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/mL)= [ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷V 样÷T=459×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 CAT 活力计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(Cpr×V 样) ÷T=459×ΔA÷Cpr
(2) 按样本质量计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样÷V 样总×W)÷T=459×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞数量计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样÷V 样总×500)÷T =0.917×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:H2O2 摩尔消光系数,43.6 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样: 加入样本体积,0.01mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞或细菌总数,500 万;106:单位换算系数,1mol=106μmol。
b. 用96 孔板测定的计算公式如下
1、血清(浆)CAT 活力的计算:
单位的定义:每 mL 血清(浆)在反应体系中每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷V 样÷T=764.5×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 CAT 活力计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(Cpr×V 样) ÷T =764.5×ΔA÷Cpr
(2) 按样本质量计算:
单位的定义:每 g 组织在反应体系中每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样÷V 样总×W)÷T=764.5×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞数量计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样÷V 样总×500)÷T=1.529×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:H2O2 摩尔消光系数,43.6 L/mol/cm;d:96 孔板光径,0.6cm;V 样: 加入样本体积,0.01mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞或细菌总数,500 万;106:单位换算系数,1mol=106μmol。
如果反应液有大量气泡产生,将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。
独立公正 方法科学 规范严谨 服务周到