过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒(钼酸铵法)-过氧化氢酶(CAT)试剂盒(钼酸铵法)-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-4535 规格:100T/48S 微量法
货号:UPLC-MS-4534 规格:50T/24S 可见分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 50mL×1

4℃保存

试剂一

液体 25mL×1

4℃保存

试剂二

粉剂×2

4℃保存

标准品

液体 0.5mL×1

4℃保存

溶液的配制:

1 试剂二:临用前取 1 瓶试剂二加入 17.5mL 蒸馏水,充分溶解,用不完的试剂 4℃保存一周。

2 20μmol/mL 标准液的配制:液体置于试剂瓶内 EP 管中,使用前需先离心。本试剂盒所提供标准品为1mmol/mL H2O2 标准溶液,临用前取 0.2mL 标准品加入 9.8mL 试剂一稀释或者根据样本量按照比例配制, 充分混匀,即为 20μmol/mL 标准液,现配现用。

产品说明:

CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是最主要的 H2O2 清除酶,在活性氧清除系统中具有重要作用。

H2O2 可与钼酸铵反应形成稳定的黄色复合物,在 405nm 处有强烈吸收峰,且其吸光值大小与过氧化氢浓度成正比。通过测定反应体系中剩余的 H2O2 量,得出被 CAT 催化分解的 H2O2 量,进而反映 CAT 的活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、恒温水浴锅、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、细菌、细胞或组织样本的制备:

a、细菌或培养细胞:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液, 超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3s,间隔 9s,重复 30 次);8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

b、组织:按照组织质量(g) :  提取液体积(V)=1 : 5~10(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样本:直接检测。

二、测定步骤

1 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 405nm,蒸馏水调零。

2 测定前将 20μmol/mL 标准液与试剂一在 25℃水浴 10min 以上。

3 加样表:

试剂名称

测定管

对照管

空白管

标准管

样本(μL

60

60

-

-

提取液(μL

-

-

60

60

20μmol/mL 标准液(μL

300

-

-

300

试剂一(μL

-

300

300

-

混匀,25℃水浴锅中准确反应 10min

试剂二(μL

540

540

540

540

混匀,室温静置 10min,于 1mL 玻璃比色皿中测定 405nm 处吸光值,分别记为 A 测定、A 对照、A 空白、A标准。计算 ΔA 测定=A 测定- A 对照,ΔA 标准=A 标准- A 空白,ΔA=ΔA 标准-ΔA 测定。空白管和标准管只需做 1-2 次。

三、CAT 活性计算

1、血清(浆)CAT 活力的计算:

单位的定义:在 25℃条件下,每 mL 血清(浆)每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/mL)=(ΔA÷ΔA 标准)×20×V 标准÷V 样÷T×F=10×(ΔA÷ΔA 标准)×F

2、组织、细菌或细胞中 CAT 活力计算:

           1) 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:在 25℃条件下,每 mg 组织蛋白每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/mg prot)=(ΔA÷ΔA 标准)×20×V 标准÷(Cpr×V 样)÷T×F=10×(ΔA÷ΔA 标准)÷Cpr×F

2) 按样本质量计算:

单位的定义:在 25℃条件下,每 g 组织每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/g 质量)=(ΔA÷ΔA 标准)×20×V 标准÷(V 样÷V 样总×W)÷T×F=10×(ΔA÷ΔA 标准)÷W×F

3) 按细菌或细胞数量计算:

单位的定义:在 25℃条件下,每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/104 cell)=(ΔA÷ΔA 标准)×20×V 标准÷(V 样÷V 样总×500)÷T×F=0.02×(ΔA÷ΔA 标准)×F

20:标准品浓度,20μmol/mL;V 标准:加入标准液体积,0.3mL;V 样:加入样本体积,0.06mL;T:反应时间,10min;F:样本稀释倍数;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

注意事项:

1. 本试剂盒多给出 25mL 的提取液,供样本稀释使用。

2. 如果反应液有大量气泡产生,将样本用提取液稀释后再进行测定。

3. 如果样本量过多,为保证反应时间(25℃,10min)的准确性,建议分成若干批次检测,每批次检测均需 1-2 个空白管与标准管。

4. 测定小于 0.12 或者约等于 A 对照时,建议将样本用提取液稀释后再进行测定。

5. 动物组织如肝脏、肾脏等酶活性较高样本,预实验建议将样本用提取液多个高倍稀释( 25 倍、50 倍、100倍等)试验后,再进行检测。


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