货号:UPLC-MS-4535 | 规格:100T/48S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4534 | 规格:50T/24S | 可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 50mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 25mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×2 瓶 |
4℃保存 |
标准品 |
液体 0.5mL×1 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前取 1 瓶试剂二加入 17.5mL 蒸馏水,充分溶解,用不完的试剂 4℃保存一周。
2、 20μmol/mL 标准液的配制:液体置于试剂瓶内 EP 管中,使用前需先离心。本试剂盒所提供标准品为1mmol/mL H2O2 标准溶液,临用前取 0.2mL 标准品加入 9.8mL 试剂一稀释或者根据样本量按照比例配制, 充分混匀,即为 20μmol/mL 标准液,现配现用。
CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是最主要的 H2O2 清除酶,在活性氧清除系统中具有重要作用。
H2O2 可与钼酸铵反应形成稳定的黄色复合物,在 405nm 处有强烈吸收峰,且其吸光值大小与过氧化氢浓度成正比。通过测定反应体系中剩余的 H2O2 量,得出被 CAT 催化分解的 H2O2 量,进而反映 CAT 的活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、恒温水浴锅、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌、细胞或组织样本的制备:
a、细菌或培养细胞:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液, 超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3s,间隔 9s,重复 30 次);8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
b、组织:按照组织质量(g) : 提取液体积(V)=1 : 5~10(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样本:直接检测。
1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 405nm,蒸馏水调零。
2、 测定前将 20μmol/mL 标准液与试剂一在 25℃水浴 10min 以上。
3、 加样表:
试剂名称 |
测定管 |
对照管 |
空白管 |
标准管 |
样本(μL) |
60 |
60 |
- |
- |
提取液(μL) |
- |
- |
60 |
60 |
20μmol/mL 标准液(μL) |
300 |
- |
- |
300 |
试剂一(μL) |
- |
300 |
300 |
- |
混匀,25℃水浴锅中准确反应 10min。 |
||||
试剂二(μL) |
540 |
540 |
540 |
540 |
混匀,室温静置 10min,于 1mL 玻璃比色皿中测定 405nm 处吸光值,分别记为 A 测定、A 对照、A 空白、A标准。计算 ΔA 测定=A 测定- A 对照,ΔA 标准=A 标准- A 空白,ΔA=ΔA 标准-ΔA 测定。空白管和标准管只需做 1-2 次。 |
1、血清(浆)CAT 活力的计算:
单位的定义:在 25℃条件下,每 mL 血清(浆)每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/mL)=(ΔA÷ΔA 标准)×20×V 标准÷V 样÷T×F=10×(ΔA÷ΔA 标准)×F
2、组织、细菌或细胞中 CAT 活力计算:
1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:在 25℃条件下,每 mg 组织蛋白每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/mg prot)=(ΔA÷ΔA 标准)×20×V 标准÷(Cpr×V 样)÷T×F=10×(ΔA÷ΔA 标准)÷Cpr×F
2) 按样本质量计算:
单位的定义:在 25℃条件下,每 g 组织每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/g 质量)=(ΔA÷ΔA 标准)×20×V 标准÷(V 样÷V 样总×W)÷T×F=10×(ΔA÷ΔA 标准)÷W×F
3) 按细菌或细胞数量计算:
单位的定义:在 25℃条件下,每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/104 cell)=(ΔA÷ΔA 标准)×20×V 标准÷(V 样÷V 样总×500)÷T×F=0.02×(ΔA÷ΔA 标准)×F
20:标准品浓度,20μmol/mL;V 标准:加入标准液体积,0.3mL;V 样:加入样本体积,0.06mL;T:反应时间,10min;F:样本稀释倍数;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
独立公正 方法科学 规范严谨 服务周到