货号:UPLC-MS-4244 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4243 | 规格:50T/48S |
紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液一 |
液体 110 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
提取液二 |
液体 110 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 10 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×1 支 |
-20℃保存 |
试剂三 |
粉剂×1 支 |
4℃保存 |
试剂四 |
液体×1 支 |
4℃保存 |
试剂五 |
液体×1 支 |
-20℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 2 mL 蒸馏水,充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
2、 试剂三:临用前加入 2 mL 蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
3、 试剂四:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 2 mL 蒸馏水充分溶解,用不完的试剂-分装后 20℃保存, 禁止反复冻融;
4、 试剂五:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 2 mL 蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存, 禁止反复冻融。
果糖 1,6-二磷酸醛缩酶(Fructose 1,6 bisphosphate aldolase,FBA)(EC4.1.2.13)是糖酵解、糖异生、磷酸戊糖途径及光合作用中参与 calvin 循环的重要酶,催化果糖 1,6-二磷酸可逆的裂解为磷酸二羟丙酮和 3-磷酸甘油醛, 广泛存在于动植物及微生物体内,在各种逆境胁迫下表现不同的响应。
果糖 1,6-二磷酸醛缩酶催化果糖 1,6-二磷酸生成 3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮,在磷酸丙糖异构酶和 α-磷酸甘油脱氢酶作用下催化 NADH 和磷酸二羟丙酮生成 NAD 和 α-磷酸甘油,340nm 处吸光值的变化可反映果糖 1,6- 二磷酸醛缩酶活性的高低。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、天平、低温离心机、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、漩涡震荡仪、超声破碎仪、冰。
①总 FBA 酶:
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液一) 充分冰浴匀浆,然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
细菌或细胞:按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液一),冰浴超声波破碎细菌或细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g, 4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
液体:直接检测。
②胞浆和叶绿体 FBA 酶的分离:
(1) 按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5-10 的比例(建议称取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液一),手工快速研磨或匀浆,之后于 4℃,200g 离心 5min;
(2) 弃沉淀,取上清在 4℃,8000g 离心 10min(离心时缓慢加速和降速);
(3) 取上清用于测定胞浆 FBA 酶活性,取沉淀加 1mL 提取液二,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎 3s, 间歇 7s,总时间 1min),然后 4℃,8000g 离心 10min,上清即为叶绿体中 FBA 酶活性。建议测定总FBA酶活性,按照步骤①提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中的FBA,则按照步骤②提取粗酶液。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定:(在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂)
|
测定管 |
空白管 |
试剂一(µL) |
100 |
100 |
试剂二(µL) |
20 |
20 |
试剂三(µL) |
20 |
20 |
试剂四(µL) |
20 |
20 |
试剂五(µL) |
20 |
20 |
样本(µL) |
20 |
- |
蒸馏水(µL) |
- |
20 |
充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1,迅速置于37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)水浴5min(有控温功能的酶标仪可以将温度调至37℃或者25℃),拿出迅速擦干测定310s时的吸光值A2,分别记为A1测定、A2 测定、A1空白和A2空白,计算ΔA测定管=A1测定-A2测定,ΔA空白管=A1空白-A2空白,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。 (空白管只需做1-2次) |
注意:如果检测样本量大,可以将试剂一、二、三、四、五按照5:1:1:1:1(V:V:V:V:V)的比例配成工作液待用(现配现用)。
A、按微量石英比色皿计算: 1、按蛋白浓度计算
酶活单位定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。FBA 酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×109×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算
酶活单位定义:每 g 组织每分消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
FBA 酶活(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×109×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷W
3、按照细胞或细菌数量计算
酶活单位定义:每 104 个细胞或细菌每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
FBA 酶活(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×109×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷细胞数量(万个)4、按液体体积计算
酶活单位定义:每 mL 液体每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。FBA 酶活(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×109×V 反总÷V 样÷T=321.54×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL, 蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
B、按 96 孔 UV 板计算:
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。
1、若 ΔA 大于 0.8 建议将样本用相应提取液进行适当的稀释再进行测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。
2、若是植物样本,建议在提取完成后 2h 内检测完,如果样本量过大,建议分批提取、检测。
3、由于提取液一中含有一定浓度的蛋白(约 0.5mg/mL),所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
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