| 货号：UPLC-MS-4188 | 规格：100T/96S | 微量法 |
| 货号：UPLC-MS-4187 | 规格：50T/48S |
紫外分光光度法 |
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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提取液 |
液体 100 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
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试剂一 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
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试剂二 |
液体 8 μL×1 瓶 |
-20℃保存 |
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试剂三 |
液体 108 μL×1 瓶 |
-20℃保存 |
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试剂四 |
液体 25 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制：
1. 试剂一：临用前加入 20 mL 试剂四充分溶解待用，用不完的试剂于 4℃保存。
2. 试剂二：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 1.1 mL 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
3. 试剂三：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 1.1 mL 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
果糖-1,6-二磷酸酶（Fructose 1,6-bisphosphatase，FBP）又称果糖-1,6-二磷酸酯酶，其在糖异生过程和光合作用同化物蔗糖的合成中起关键性的作用。催化1,6-二磷酸果糖和水生成6-磷酸果糖和无机磷。
FBP催化1,6-二磷酸果糖和水，生成6-磷酸果糖和无机磷，在反应体系中添加的磷酸葡萄糖异构酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，测定340nm下NADPH的增加速率，即可计算FBP活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、天平、低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰盒、蒸馏水。
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆。于 4℃，8000g，离心 10min，取上清，置冰上待测。
细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min），于 4℃，8000g，离心 10min，取上清，置冰上待测。
1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 将试剂一37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10min。
3、 操作表：(在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入下列试剂)
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测定管 |
空白管 |
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样本（µL） |
20 |
- |
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提取液（µL） |
- |
20 |
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试剂二（µL） |
10 |
10 |
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试剂三（µL） |
10 |
10 |
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试剂一（µL） |
160 |
160 |
在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分别加入上述试剂，充分混匀后于 340nm 处测定 10s 时的吸光值 A1，迅速置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴或培养箱 5min（酶标仪有控温功能可直接调节温度），拿出迅速擦干测定 310s 时的吸光值 A2，计算 ΔA 测定管=A2 测定-A1 测定，ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。（空白管只需做 1-2 次）
A 按微量石英比色皿计算
1. 按蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
FBP（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷(Cpr×V样) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr
2. 按样本质量计算
单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
FBP（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T=321.5×ΔA÷W
3. 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每104个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
FBP（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量（万个）) ÷T=321.5×ΔA÷细胞数量（万个）
V反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔UV板光径）进行计算即可。
1、 当ΔA大于0.6时，建议将样本稀释后再进行测量。
2、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.02。
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