果糖-1,6-二磷酸(酯)酶(FBP)活性检测试剂盒-果糖-1,6-二磷酸(酯)酶(FBP)试剂盒-上海液质



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货号:UPLC-MS-4188 规格:100T/96S 微量法
货号:UPLC-MS-4187 规格:50T/48S 紫外分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 100 mL×1

4℃保存

试剂一

粉剂×1

4℃保存

试剂二

液体 8 μL×1

-20℃保存

试剂三

液体 108 μL×1

-20℃保存

试剂四

液体 25 mL×1

4℃保存

溶液的配制:

1. 试剂一:临用前加入 20 mL 试剂四充分溶解待用,用不完的试剂于 4℃保存。

2. 试剂二:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 1.1 mL 蒸馏水充分溶解待用,用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。

3. 试剂三:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 1.1 mL 蒸馏水充分溶解待用,用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。

产品说明:

果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose 1,6-bisphosphatase,FBP)又称果糖-1,6-二磷酸酯酶,其在糖异生过程和光合作用同化物蔗糖的合成中起关键性的作用。催化1,6-二磷酸果糖和水生成6-磷酸果糖和无机磷。

FBP催化1,6-二磷酸果糖和水,生成6-磷酸果糖和无机磷,在反应体系中添加的磷酸葡萄糖异构酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH,测定340nm下NADPH的增加速率,即可计算FBP活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、天平、低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰盒、蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

组织:按照质量(g):提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆。于 4℃,8000g,离心 10min,取上清,置冰上待测。

细胞:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL) 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min),于 4℃,8000g,离心 10min,取上清,置冰上待测。

二、测定步骤

1 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2 将试剂一37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10min。

3 操作表:(在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入下列试剂)

 

测定管

空白管

样本(µL

20

-

提取液(µL

-

20

试剂二(µL

10

10

试剂三(µL

10

10

试剂一(µL

160

160

在微量石英比色皿/96 UV 板中分别加入上述试剂,充分混匀后于 340nm 处测定 10s 时的吸光值 A1,迅速置于 37℃(哺乳动物) 25℃(其它物种)水浴或培养箱 5min(酶标仪有控温功能可直接调节温度),拿出迅速擦干测定 310s 时的吸光值 A2,计算 ΔA 测定管=A2 测定-A1 测定,ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。(空白管只需做 1-2 次)

三、FBP 酶活性计算

A 按微量石英比色皿计算

        1. 按蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

FBP(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(Cpr×V样) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr

2. 按样本质量计算

单位的定义:每g组织每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

FBP(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T=321.5×ΔA÷W

3. 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每104个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

FBP(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量(万个)) ÷T=321.5×ΔA÷细胞数量(万个)

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W 样本质量,g;109:单位换算系数,1mol=109nmol。

B 96孔板计算

将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔UV板光径)进行计算即可。

注意事项:

1 ΔA大于0.6时,建议将样本稀释后再进行测量。

2 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过0.02。


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