货号:UPLC-MS-4198 | 规格:100T/48S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4197 | 规格:50T/24S |
可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液一 |
液体 60 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
提取液二 |
液体 10 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 10 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×1 支 |
4℃保存 |
试剂三 |
液体 7 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂四 |
液体 20 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
标准品 |
粉剂×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 0.3mL 蒸馏水,充分溶解后待用,用不完的试剂 4℃保存,4℃保存一周;
2、 标准品:临用前加入 1176 μL 蒸馏水充分溶解,配制成 50 μmol/mL 果糖-1,6-二磷酸标准溶液。
果糖 1,6-二磷酸(fructose-1,6-diphosphate, FDP)是糖酵解过程中的一种重要的中间产物,对多种酶具有调节作用,具有改善细胞能量代谢、增加能量利用、抗心律失常及抗组织过氧化等作用,广泛应用于临床医药。
醛缩酶催化果糖 1,6-二磷酸裂解,产物与 2,4-二硝基苯肼在酸性介质中反应生成 2,4-二硝基苯腙,在碱性溶液中呈红棕色,在 540nm 处有特征吸收峰。
增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 组织:按照质量(g):提取液一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液一)加入提取液一,冰浴匀浆后于4℃,12000g离心10min,取0.8mL上清液,再加入0.16mL提取液二,4℃,12000g离心10min 后取上清待测。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液一)加入提取液一,冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);于4℃,12000g离心10min,取0.8mL上清液,再加入0.16mL提取液二,4℃,12000g离心10min后取上清待测。
3. 血清(浆):取100μL血清(浆)加入1mL提取液一,4℃,12000g离心10min,取0.8mL上清液,再加入0.16mL 提取液二,4℃,12000g离心10min后取上清待测。
1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。
2、 将50µmol/mL的果糖-1,6-二磷酸标准液用蒸馏水倍比稀释为3.125、1.5625、0.78125、0.39、0.2、0.1 µmol/mL的标准溶液备用。
3、 样本测定:(在1.5 mL离心管或96孔板中操作)
试剂名称(µL) |
对照管 |
测定管 |
空白管 |
标准管 |
样本 |
20 |
20 |
- |
- |
蒸馏水 |
- |
- |
20 |
- |
标准溶液 |
- |
- |
- |
20 |
试剂一 |
44 |
40 |
44 |
40 |
试剂二 |
- |
4 |
- |
4 |
充分混匀,37℃准确反应2 h |
||||
试剂三 |
40 |
40 |
40 |
40 |
充分混匀,37℃准确反应20 min |
||||
试剂四 |
100 |
100 |
100 |
100 |
充分混匀,37℃准确反应10 min |
||||
于微量玻璃比色皿/96孔板中测定540nm处吸光值A,分别记为A对照管、A测定管、A空白管和A标准管。计算ΔA=A测定管-A对照管,ΔA标准=A标准管-A空白管。(空白需检测1-2次) |
1、 标准曲线的绘制:
以各个标准溶液的浓度为 x 轴,其对应的 ΔA 标准为 y 轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y= kx+b,将 ΔA 带入方程得到 x(µmol/mL)。
2、FDP 含量的计算:
(1) 按样本质量计算
FDP 含量(µg/g 质量)=x×(V 上清+V 提取液二)×M÷(W×V 上清÷V 提取液一)=408x÷W
(2) 按细胞数量计算
FDP 含量(µg/104 cell)=x×(V 上清+V 提取液二)×M÷(V 上清÷V 提取液一×细胞数量(万个))=408x÷细胞数量(万个)
(3) 按液体体积计算
FDP含量(µmol/mL)=x×(V上清+V提取液二)÷ [V液体×V上清÷(V提取液一+V液体)]=13.2x
V 上清:提取时上清液体积,0.8mL;V 提取液二:提取液二的体积,0.16mL;V 提取液一:提取液一的体积,1mL; W:样本质量,g;M:果糖-1,6-二磷酸分子质量,340;V 液体:液体样本体积,0.1mL。
当ΔA测定大于0.5时,建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定,计算公式中乘以稀释倍数。
独立公正 方法科学 规范严谨 服务周到