货号:UPLC-MS-4141 | 规格:100T/48S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4140 | 规格:50T/24S | 可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 100mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 25mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
液体 20 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
标准品 |
粉剂×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、试剂一:若溶液中有不溶解物质,可以 50℃水浴溶解。
2、标准品:10mg 半乳糖醛酸。临用前加入 0.943mL 蒸馏水,配成 50μmol/mL 的标准液。
果胶酶(pectinase)是分解果胶的酶类,包括原果胶酶,果胶酯酶,多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶四大类, 广泛存在于高等植物果实和微生物中,是水果加工中最重要的酶。
果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸,半乳糖醛酸与 DNS 试剂反应生成在 540nm 有特征吸收峰的棕红色物质, 测定 540nm 处吸光值变化可计算得果胶酶活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量玻璃比色皿/96 孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液) 进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
2、菌类:按照细菌数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细菌(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
3、液体:直接检测。
1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min 以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。
2、 将 50μmol/mL 标准液用蒸馏水稀释为 10、8、6、4、2、1 μmol/mL 的标准溶液备用。
3、 取 40μL 样本沸水浴 10min 备用。
4、 样本测定(在1.5mL离心管中):
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对照管 |
测定管 |
标准管 |
空白管 |
试剂一(µL) |
200 |
200 |
200 |
200 |
50℃水浴温育5min |
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标准溶液(µL) |
- |
- |
40 |
- |
样本(µL) |
- |
40 |
- |
- |
蒸馏水(µL) |
- |
- |
- |
40 |
煮沸样本(µL) |
40 |
- |
- |
- |
混匀,50℃水浴反应30min,马上沸水浴5min,冷却后8000g,常温离心10min,取上清。 |
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上清液(µL) |
150 |
150 |
150 |
150 |
试剂二(µL) |
150 |
150 |
150 |
150 |
沸水浴5min,冰浴冷却终止反应,吸取200μL于微量玻璃比色皿或96孔板中测定540nm处吸光值A,计算 ΔA=A测定管-A对照管,ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管。 |
1、 标准曲线的绘制:
以各个标准溶液的浓度为 x 轴,其对应的 ΔA 标准为 y 轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y=kx+b,将 ΔA 带入方程得到 x(μmol/mL)。
2、 果胶酶活性的计算:
(1) 按蛋白浓度计算
酶活定义:在 50℃,pH3.5 条件下,每毫克蛋白每小时分解果胶产生 1μmol 半乳糖醛酸为 1 个酶活力单位。果胶酶活性(U/mg prot)=x×V 提取÷(V 提取×Cpr)÷T= 2x÷Cpr
(2) 按样本质量计算
酶活定义:在 50℃,pH3.5 条件下,每克样本每小时分解果胶产生 1μmol 半乳糖醛酸为 1 个酶活力单位。果胶酶活性(U/g 质量)= x×V 提取÷W÷T=2x÷W
(3) 按照细菌数量计算
酶活定义:在 50℃,pH3.5 条件下,每 104 个细菌每小时分解果胶产生 1μmol 半乳糖醛酸为 1 个酶活力单位。果胶酶活性(U/104 cell)= x×V 提取÷T÷细菌数量(万个)=2x÷细菌数量(万个)
(4) 按液体体积计算
酶活定义:在 50℃,pH3.5 条件下,每 mL 样本每小时分解果胶产生 1μmol 半乳糖醛酸为 1 个酶活力单位。果胶酶活性(U/mL)= x×V 样÷V 样÷T= 2x
V 提取:提取液体积,1mL; V 样:加入的样本体积,0.04mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,0.5h。
1、 A 大于 1.5 时,建议将样本用提取液稀释后再进行测定。
2、 植物果实组织建议将样本用提取液稀释 10 倍或 20 倍后再测定。
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