| 货号：UPLC-MS-4143 | 规格：100T/96S | 微量法 |
| 货号：UPLC-MS-4142 | 规格：50T/48S | 紫外分光光度法 |
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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提取液 |
液体 120 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
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试剂一 |
液体 15 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制：
试剂一：溶液中如果有沉淀存在，可以 50℃水浴助溶。
果胶裂解酶（EC4.2.2.10）是果胶酶的重要组成部分，催化果胶分子链的消除裂解。来源比较广泛，主要来源于微生物，在食品加工工业中提高果汁产量方面有重要意义，在减少环境污染和降低能源消耗方面也具有潜在的应用价值。
果胶裂解酶作用于果胶中的 α-1,4 糖苷键，生成在还原端 C4 和 C5 之间位置具有不饱和键的不饱和寡聚半乳糖醛酸，在 235nm 处有特征吸收峰，测定 235nm 下吸光度的上升来表示果胶裂解酶的活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）， 进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃离心 10min， 取上清置于冰上待测。
3. 培养液：直接测定。
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 235nm，蒸馏水调零。
2、 操作表：
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试剂名称 |
测定管 |
空白管 |
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试剂一（μL） |
180 |
180 |
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酶液（μL） |
20 |
- |
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蒸馏水（μL） |
- |
20 |
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充分混匀后测定 235nm 下的初始值 A1，40℃反应 30min 后再次测定吸光值 A2，计算 ΔA 测定管=A2 测定管-A1 测定管，ΔA 空白管= A2 空白管-A1 空白管，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。 |
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A、按微量石英比色皿计算：
1. 按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在 40℃，pH5.5 条件下，每毫克蛋白每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷（V 样×Cpr）÷T=64.1×ΔA÷Cpr
2. 按照样本质量计算
酶活性定义：在 40℃，pH5.5 条件下，每克组织每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷（V 样×W÷V 样总）÷T= 64.1×ΔA÷W
3. 按照细菌、真菌数量计算
酶活性定义：在 40℃，pH5.5 条件下，每 104 个细胞每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性（U/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T= 64.1×ΔA÷细胞数量
4. 按照培养液体积计算
酶活性定义：在 40℃，pH5.5 条件下，每毫升培养液每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷V 样÷T= 64.1×ΔA
ε：不饱和半乳糖醛酸摩尔消光系数：5200 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，0.0002 L；V 样：反应体系中样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W， 样本质量，g；T：反应时间，30min；109：换算系数，1mol=109nmol。
将上述公式中的 d-1cm 修改为 d-0.6cm（96 孔板光径）进行计算即可。
1、 若 ΔA 大于 0.5，将粗酶液用蒸馏水稀释后再进行测定。若 A 测定管大于 1.5 时，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。
2、 建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。
3、 空白管正常情况下变化不超过 0.02。
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