果胶裂解酶(PL)活性检测试剂盒-果胶裂解酶(PL)试剂盒-上海液质



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货号:UPLC-MS-4143 规格:100T/96S 微量法
货号:UPLC-MS-4142 规格:50T/48S 紫外分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 120 mL×1

4℃保存

试剂一

液体 15 mL×1

4℃保存

溶液的配制:

试剂一:溶液中如果有沉淀存在,可以 50℃水浴助溶。

产品说明:

果胶裂解酶(EC4.2.2.10)是果胶酶的重要组成部分,催化果胶分子链的消除裂解。来源比较广泛,主要来源于微生物,在食品加工工业中提高果汁产量方面有重要意义,在减少环境污染和降低能源消耗方面也具有潜在的应用价值。

果胶裂解酶作用于果胶中的 α-1,4 糖苷键,生成在还原端 C4 C5 之间位置具有不饱和键的不饱和寡聚半乳糖醛酸,在 235nm 处有特征吸收峰,测定 235nm 下吸光度的上升来表示果胶裂解酶的活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液), 进行冰浴匀浆。10000g ,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL) 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声秒,间隔秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃离心 10min 取上清置于冰上待测。

3. 培养液:直接测定。

二、测定步骤

1 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 235nm,蒸馏水调零。

2 操作表:

试剂名称

测定管

空白管

试剂一(μL

180

180

酶液(μL

20

-


蒸馏水(μL

-

20

充分混匀后测定 235nm 下的初始值 A140℃反应 30min 后再次测定吸光值 A2,计算 ΔA 测定管=A2 测定管-A1 测定管,ΔA 空白管= A2 空白管-A1 空白管,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。

三、果胶裂解酶活性计算

A、按微量石英比色皿计算:

1. 按照蛋白浓度计算

酶活性定义:在 40℃,pH5.5 条件下,每毫克蛋白每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

PL 活性(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×Cpr)÷T=64.1×ΔA÷Cpr

2. 按照样本质量计算

酶活性定义:在 40℃,pH5.5 条件下,每克组织每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

PL 活性(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×W÷V 样总)÷T= 64.1×ΔA÷W

3. 按照细菌、真菌数量计算

酶活性定义:在 40℃,pH5.5 条件下,每 104 个细胞每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

PL 活性(U/104 cell)= ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×细胞数量÷V 样总)÷T= 64.1×ΔA÷细胞数量

4. 按照培养液体积计算

酶活性定义:在 40℃,pH5.5 条件下,每毫升培养液每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

PL 活性(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷V 样÷T= 64.1×ΔA

ε:不饱和半乳糖醛酸摩尔消光系数:5200 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应总体积,0.0002 L;V 样:反应体系中样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W 样本质量,g;T:反应时间,30min;109:换算系数,1mol=109nmol。

B、按 96 UV 板计算:

将上述公式中的 d-1cm 修改为 d-0.6cm(96 孔板光径)进行计算即可。

注意事项:

1 ΔA 大于 0.5,将粗酶液用蒸馏水稀释后再进行测定。若 A 测定管大于 1.5 时,建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。

2 建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。

3 空白管正常情况下变化不超过 0.02。


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