| 货号：UPLC-MS-4491 | 规格：100T/96S | 微量法 |
| 货号：UPLC-MS-4490 | 规格：50T/48S | 紫外分光光度法 |
|
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
|
试剂一 |
液体 120 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
|
试剂二 |
液体 1 mL×1 支 |
4℃保存 |
|
试剂三 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂三：临用前加入 2.0 mL 蒸馏水，混匀。
GR 是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，GR 是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中 GR 被 TrxR 取代）。GR 催化 NADPH 还原 GSSG 生成 GSH，有助于维持体内 GSH/GSSG 比值。GR
在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外 GR 还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。GR 能催化 NADPH 还原 GSSG 再生 GSH，同时 NADPH 脱氢生成 NADP+；NADPH 在 340nm 有特征吸收峰， 相反 NADP+在该波长无吸收峰；通过测定 340nm 吸光度下降速率来测定 NADPH 脱氢速率，从而计算 GR 活性。
需自备的仪器和用品：
低温离心机、水浴锅、移液器、匀浆器/研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔 UV 板和蒸馏水。
称约 0.1g 组织，加入 1.0 mL 试剂一，冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心 10min，取上清液，待测。
注：样本测定 10s 时吸光度后，将比色皿放入 25℃（普通物质）或者 37℃（哺乳动物）水浴，3min 后拿出，吸打混匀，立即测定 190s 时的吸光度。
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫克蛋白每分钟催化 1μmol NADPH 氧化为一个酶活力单位。GR 酶活(U/mg prot)= [ (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106] ÷（Cpr×V 样）÷T=0.536×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷Cpr
（2） 按样本质量计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每克样本每分钟催化 1μmol NADPH 氧化为一个酶活力单位。GR 酶活(U/g 质量)= [ (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106] ÷(V 样÷V 样总×W)÷T=0.536×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W
ΔA 空白管=A 空 1-A 空 2，ΔA 测定管=A 测 1-A 测 2；ε：NADPH 摩尔消光系数 6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4L；106：单位换算系数，1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=2×10-2mL；V 样总：样本总体积，1mL； T：反应时间，3min。
b. 使用96 孔板测定的计算公式如下
（1） 按蛋白浓度计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫克蛋白每分钟催化 1μmol NADPH 氧化为一个酶活力单位。GR 酶活(U/mg prot)=[ (ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d)×V 反总×106]÷（Cpr×V 样）÷T=0.893×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷Cpr
（2） 按样本质量计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每克样本每分钟催化 1μmol NADPH 氧化为一个酶活力单位。GR 酶活(U/g 质量)=[(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106]÷(V 样÷V 样总×W)÷T=0.893×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W
ΔA 空白管=A 空 1-A 空 2，ΔA 测定管=A 测 1-A 测 2；ε：NADPH 摩尔消光系数 6.22×103L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.6cm；V 反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4L；106：单位换算系数，1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL =2×10-2mL；V 样总：样本总体积，1mL；T：反应时间，3min。
1、 样本处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；
2、 试剂三须现配现用，配置完后，置于冰上；
3、 测定前须先用 1-2 个样做预实验，哺乳动物组织一般须用试剂一稀释 2-5 倍；
4、 由于试剂一中含有一定浓度的蛋白（约 0.1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去试剂一本身的蛋白含量。
独立公正 方法科学 规范严谨 服务周到
