谷胱甘肽还原酶(GR)活性检测试剂盒-谷胱甘肽还原酶(GR)试剂盒-上海液质



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货号:UPLC-MS-4491 规格:100T/96S 微量法
货号:UPLC-MS-4490  规格:50T/48S 紫外分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

试剂一

液体 120 mL×1

4℃保存

试剂二

液体 1 mL×1

4℃保存

试剂三

粉剂×1

4℃保存

溶液的配制:

1、试剂三:临用前加入 2.0 mL 蒸馏水,混匀。

产品说明:

GR 是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶,GR 是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一通常昆虫中 GR  TrxR 取代)。GR 催化 NADPH 还原 GSSG 生成 GSH,有助于维持体内 GSH/GSSG 比值。GR

在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用,此外 GR 还参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环途径。GR 能催化 NADPH 还原 GSSG 再生 GSH,同时 NADPH 脱氢生成 NADP+;NADPH 340nm 有特征吸收峰, 相反 NADP+在该波长无吸收峰;通过测定 340nm 吸光度下降速率来测定 NADPH 脱氢速率,从而计算 GR 活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

低温离心机、水浴锅、移液器、匀浆器/研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 UV 板和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

称约 0.1g 组织,加入 1.0 mL 试剂一,冰上充分研磨,10000rpm 4℃离心 10min,取上清液,待测。

二、测定步骤

1. 分光光度计或酶标仪预热 30 min 以上,调节波长到 340nm,蒸馏水调零。

2. 试剂一置于 25℃(普通物质)或者 37℃(哺乳动物)中预热 30min 以上。

3. 空白管:取微量石英比色皿或 96 孔板,加入 10μL 试剂二,20μL 试剂三,170μL 试剂一,于 340nm 测定 10s 190s 吸光度,记为 A 1 A 2。

4. 测定管:取微量石英比色皿或 96 孔板,加入 10μL 试剂二,20μL 试剂三,20μL 上清液,150μL 试剂一,于 340nm测定 10s 190s 吸光度,记为 A 1 A 2。

注:样本测定 10s 时吸光度后,将比色皿放入 25℃(普通物质)或者 37℃(哺乳动物)水浴,3min 后拿出,吸打混匀,立即测定 190s 时的吸光度。

三、GR 活性计算

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0 条件下,每毫克蛋白每分钟催化 1μmol NADPH 氧化为一个酶活力单位。GR 酶活(U/mg prot)= [ (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106] ÷(Cpr×V 样)÷T=0.536×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷Cpr

(2) 按样本质量计算

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0 条件下,每克样本每分钟催化 1μmol NADPH 氧化为一个酶活力单位。GR 酶活(U/g  质量)= [ (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106] ÷(V 样÷V 样总×W)÷T=0.536×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W

ΔA 空白管=A 1-A 2,ΔA 测定管=A 1-A 2;ε:NADPH 摩尔消光系数 6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应体系总体积,200μL=2×10-4L;106:单位换算系数,1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;V 样:加入反应体系中上清液体积,20μL=2×10-2mL;V 样总:样本总体积,1mL T:反应时间,3min。

b.  使用96 孔板测定的计算公式如下

(1) 按蛋白浓度计算

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0 条件下,每毫克蛋白每分钟催化 1μmol NADPH 氧化为一个酶活力单位。GR 酶活(U/mg prot)=[ (ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d)×V 反总×106]÷(Cpr×V 样)÷T=0.893×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷Cpr

(2) 按样本质量计算

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0 条件下,每克样本每分钟催化 1μmol NADPH 氧化为一个酶活力单位。GR 酶活(U/g 质量)=[(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106]÷(V 样÷V 样总×W)÷T=0.893×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W

ΔA 空白管=A 1-A 2,ΔA 测定管=A 1-A 2;ε:NADPH 摩尔消光系数 6.22×103L/mol/cm;d:96 孔板光径,0.6cm;V 反总:反应体系总体积,200μL=2×10-4L;106:单位换算系数,1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;V 样:加入反应体系中上清液体积,20μL =2×10-2mL;V 样总:样本总体积,1mL;T:反应时间,3min。

注意事项:

1 样本处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力,匀浆液避免反复冻融;

2 试剂三须现配现用,配置完后,置于冰上;

3 测定前须先用 1-2 个样做预实验,哺乳动物组织一般须用试剂一稀释 2-5 倍;

4 由于试剂一中含有一定浓度的蛋白 0.1mg/mL),所以在测定样本蛋白浓度时需要减去试剂一本身的蛋白含量。


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