货号:UPLC-MS-4499 | 规格:100T/48S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4498 | 规格:50T/24S |
可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 60 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
粉剂×2 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
液体 10 μL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
液体 30mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂四 |
液体 15 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂五 |
液体 5mL×1 瓶 |
4℃保存 |
标准品 |
粉剂×1 支 |
4℃保存 |
稀释液 |
液体 20 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂一:临用前加入 3.3 mL 稀释液,充分溶解;
2、 试剂二:临用前按 2 μL 试剂二:10 mL 蒸馏水的比例稀释试剂二,现用现配;
3、 试剂三:瓶底若有结晶可 50℃水浴溶解,此溶液为饱和溶液,若底部最终还有结晶,吸取上清使用即可;
4、 标准品:10 mg 还原型谷胱甘肽。临用前加入 0.405 mL 稀释液溶解为 80 μmol/mL 的标准溶液备用。
谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px 或 GPX)是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GPX 能够催化还原型谷胱甘肽(GSH)生成氧化型谷胱甘肽(GSSG),使有毒的过氧化氢还原成无毒的羟基化合物。
GPX 催化 H2O2 氧化 GSH,产生 GSSG,GSH 能与 DTNB 生成在 412nm 处有特征吸收峰的化合物,412nm 下吸光度的下降即可反应 GPX 的活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、天平、台式离心机、微量玻璃比色皿/96 孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP 管。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取 0.05 g 组织,加入 1 mL 提取液)进行冰浴匀浆。5000 rpm,4℃离心 10 min,取上清置冰上待测 (如上清不清澈可以离心更长时间)。
2、细菌、细胞:按照细胞数量 104 个:提取液体积(mL)500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1 mL 提取液), 冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3s,间隔 7s,总时间 3 min)然后 5000 rpm,4℃,离心 10min,取上清置冰上待测 (如上清不清澈可以离心更长时间)。
3、血清(浆)等液体:直接测定。
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 412 nm,蒸馏水调零。
2、 将 80 μmol/mL 标准液用稀释液稀释为 0.08 μmol/mL 的标准溶液,现用现配。
3、 操作表:(在 1.5 mL 离心管中依次加入下列试剂)
|
测定管 |
对照管 |
样本上清液(µL) |
20 |
- |
试剂一(μL) |
20 |
20 |
37℃下预热 5min |
||
试剂二(µL) |
10 |
10 |
37℃下反应 5min |
||
试剂三(μL) |
200 |
200 |
样本上清液(µL) |
- |
20 |
试剂名称(μL) |
测定管 |
对照管 |
标准管 |
空白管 |
稀释液 |
- |
- |
- |
100 |
上清液 |
100 |
100 |
- |
- |
标准液 |
- |
- |
100 |
- |
试剂四 |
100 |
100 |
100 |
100 |
试剂五 |
25 |
25 |
25 |
25 |
充分混匀,室温静置 15 min,测定 412 nm 下的吸光度,分别记为 A 测定管、A 对照管、A 标准管、A 空白管。计算 ΔA 测定=A 对照管-A 测定管,ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。
1、 抑制百分率的计算
抑制百分率=(A 对照管-A 测定管) ÷(A 对照管-A 空白管)× 100%
尽量使样本的抑制百分率在 30-70%范围内,越靠近 50%越准确。如果计算出来的抑制百分率小于 30%或大于70%,则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高,则需适当稀释样本;如果测定出来的抑制百分率偏低,则需重新准备浓度比较高的待测样本。
2、 GPX 活性计算
(1) 按蛋白浓度计算
活力单位定义:每 mg 蛋白在反应体系中每分钟催化 1 nmol GSH 氧化定义为一个酶活力单位。GPX (U/mg prot) =ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标)×1000×V 酶促÷(Cpr×V 样)÷T=200×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr
(2) 按样本质量计算
活力单位定义:每 g 样本在反应体系中每分钟催化 1 nmol GSH 氧化定义为一个酶活力单位。GPX (U/g 质量)= ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标)×1000×V 酶促÷(V 样÷V 样总×W)÷T=200×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W
(3) 按细胞数量计算
活力单位定义:每 104 个细胞在反应体系中每分钟催化 1 nmol GSH 氧化定义为一个酶活力单位。GPX (U/104 cell)=ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标)×1000×V 酶促÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=200×ΔA 测定÷ΔA 标准÷细胞数量
(4) 按液体体积计算
活力单位定义:每
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