谷胱甘肽 S-转移酶(GST)活性检测试剂盒-谷胱甘肽 S-转移酶(GST)试剂盒-上海液质



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货号:UPLC-MS-4497 规格:100T/96S 微量法
货号:UPLC-MS-4496 规格:50T/48S 紫外分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

试剂一

液体 100 mL×1

4℃保存

试剂二

液体 22 mL×1

4℃保存

试剂三

粉剂×1

4℃保存

溶液配制:

试剂三:临用前加 2 mL 蒸馏水溶解。

产品说明:

GST 是一种具有多种生理功能的蛋白质家族,主要存在于细胞质内。GST 是体内解毒酶系统的重要组成部分, 主要催化各种化学物质及其代谢产物与 GSH 的巯基共价结合,使亲电化合物变为亲水物质,易于从胆汁或尿液中排泄,达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此,GST 在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外,因为 GST 具有 GSH-Px 活性,亦称为 non-Se GSH-Px,具有修复氧化破坏的大分子如 DNA、蛋白质等的功能。注意,GST 催化的反应减少 GSH 含量,但是不增加 GSSG 含量。

GST 催化 GSH CDNB 结合,其结合产物的光吸收峰波长为 340nm;通过测定 340nm 波长处吸光度上升速率,即可计算出 GST 活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

自备仪器和用品:

低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外-可见分光光度计/酶标仪、研钵/匀浆器、微量石英比色皿/96 UV

板和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一 进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL) 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3 . 血清等液体:直接测定。

二、测定步骤

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长到 340nm,用蒸馏水调零。

2. 试剂二放在 25℃(一般物种)或者 37℃(哺乳动物)保温.

3. 空白管:取微量石英比色皿,加入 20μL 试剂一,180μL 试剂二和 20μL 试剂三,迅速混匀后于 340nm 测定 10s吸光度记 A1,在 25℃(一般物种)或者 37℃(哺乳动物)水浴 5min 后,快速取出测定吸光度记 A2。

4. 测定管:取微量石英比色皿,加入 20μL 上清液,180μL 试剂二和 20μL 试剂三,迅速混匀后于 340nm 测定 10s吸光度记 A3,25℃(一般物种)或者 37℃(哺乳动物)水浴 5min 后,快速取出测定吸光度记 A4。

三、GST 活性计算

         a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、按蛋白浓度计算

活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每毫克蛋白每分钟催化 1μmol CDNB GSH 结合为一个酶活性单位。GST(U/mg prot)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)]÷Cpr

2、按样本质量计算

活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每克样本每分钟催化 1μmol CDNB GSH 结合为一个酶活性单位。GST(U/g 质量)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷W

3、按细胞数量计算

活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每 104 个细胞每分钟催化 1μmol CDNB GSH 结合为一个酶活单位。

GST( U/104 cell) =[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷T =0.23× [(A4-A3)-(A2-A1)]÷500

4、按液体体积计算

活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每毫升液体每分钟催化 1μmol CDNB GSH 结合为一个酶活单位。GST(U/mL)= [(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反总÷V 样÷T =0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)]

ε:产物摩尔消光系数,9.6×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;106:单位换算系数,1mol=1×106μmol;V 反总:反应体系总体积,220μL=2.2×10-4L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;W  :样本质量,g;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V 样总:试剂一体积,1mL;T:反应时间,5min;500:细胞数量,500 万。

b.  使用96 孔板测定的计算公式如下

1、按蛋白浓度计算

活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每毫克蛋白每分钟催化 1μmol CDNB GSH 结合为一个酶活性单位。GST(U/mg prot)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T=0.38×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷Cpr

2、按样本质量计算

活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每克样本每分钟催化 1μmol CDNB GSH 结合为一个酶活性单位。GST(U/g 质量)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T =0.38×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷W

3、按细胞数量计算

活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每 104 个细胞每分钟催化 1μmol CDNB GSH 结合为一个酶活单位。

GST(U/104 cell)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷T =0.38×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷500

4、按液体体积计算

活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每毫升液体每分钟催化 1μmol CDNB GSH 结合为一个酶活单位。GST(U/mL)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反总÷V 样÷T=0.38×[(A4-A3)-(A2-A1)]

ε:产物摩尔消光系数,9.6×103L/mol/cm;d:96 孔板光径,0.6cm;106:单位换算系数,1mol=1×106μmol;V 反总:反应体系总体积,220μL=2.2×10-4L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;W  :样本质量,g;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V 样总:加入试剂一体积,1 mL;T:反应时间,5min;500 细胞数量,500 万。

注意事项:

1. 样本处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力;

2. 细胞中 GST 活性测定时,细胞数目须在 300 万-500 万之间,细胞中 GST 的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞;

3. 若样本测定吸光度大于 1,建议对样本用蒸馏水稀释,计算时结果乘以稀释倍数;

4. 测定反映的温度对测定结果有影响,请控制在 25℃或者 37℃(哺乳动物)。


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