货号:UPLC-MS-4471 | 规格:100T/48S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4470 | 规格:50T/24S | 可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 60 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
粉剂×2 支 |
4℃保存 |
试剂二 |
液体 3.5 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
液体 30 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
标准品 |
液体 1 mL×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂一:提供 1 个 8 mL 空瓶;临用前取 1 支试剂一倒入空瓶中,用 2 mL 蒸馏水溶解,再用溶液将试剂一残留的试剂润洗下来,现用现配;
2、 标准品:20 μmol/mL 丙酮酸钠。
谷草转氨酶又叫天门冬氨酸氨基转移酶( 2.6.1.1),广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化可逆转氨基反应,是氨基酸代谢的重要酶。此外,GOT在心肌细胞中含量最高,临床上一般常作为心肌梗塞和心肌炎的辅助检查。肝脏损害时其血清浓度也可升高。
GOT催化α-酮戊二酸和天门冬氨酸发生转氨基反应,生成谷氨酸和草酰乙酸,草酰乙酸进一步自行脱羧生成丙酮酸;丙酮酸可与2,4-二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙,在碱性条件下显棕红色;测定505nm吸光度的变化, 即可计算GOT酶活力。
需自备的仪器和用品:
可见分光光计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细胞或细菌样本的制备:先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。3500g,4℃离心 10min,取上清, 置冰上待测。
2、组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。3500g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样本:直接检测。
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至505nm,蒸馏水调零。
2、标准曲线的测定:首先将标准品用蒸馏水稀释至2μmol/mL,按下表混合标准品和试剂一得到相应浓度的标准管:
标准品(μL) |
试剂一(μL) |
标准管浓度(μmol/mL) |
22.5 |
7.5 |
1.5 |
15 |
15 |
1 |
12 |
18 |
0.8 |
6 |
24 |
0.4 |
3 |
27 |
0.2 |
1.5 |
28.5 |
0.1 |
0.75 |
29.25 |
0.05 |
0 |
30 |
0 |
3、在 EP 管或在 96 孔板中加入下列试剂
试剂名称(μL) |
测定管 |
对照管 |
标准管 |
待测样本 |
5 |
|
|
试剂一 |
25 |
25 |
|
标准液 |
|
|
30 |
混匀后,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)反应30min |
|||
试剂二 |
25 |
25 |
25 |
待测样本 |
|
5 |
|
混匀后,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确反应20min |
|||
试剂三 |
240 |
240 |
240 |
混匀,室温放置10min,在505nm波长处测各管吸光度。
注:0μmol/mL 标准管为空白管。
三、GOT 活性计算
1、标准曲线的绘制:
以各标准溶液浓度为x轴,以∆A(A标准管-A空白管)为y轴做标准曲线,得到方程y=kx+b。将(A测定管-A 对照管)带入方程求x值。
2、GOT活性计算:
(1) 按样本质量计算:
单位定义:每小时每g样本催化产生1μmol丙酮酸的量为一个GOT活力单位。
GOT(U/g 质量)=x×(V样本+V试剂一)÷(W×V样本÷V样总)÷T=12x÷W
(2) 按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每小时每mg组织蛋白催化产生1μmol丙酮酸的量为一个GOT活力单位。
GOT(U/mg prot)=x×(V样本+V试剂一)÷(Cpr×V样本)÷T=12x÷Cpr
(3) 按血清(浆)体积计算:
单位定义:每小时每mL血清样本催化产生1μmol丙酮酸的量为一个GOT活力单位。
GOT(U/mL)=x×(V样本+V试剂一)÷V样本÷T=12x
(4) 按细菌或细胞数量计算:
单位定义:每小时每104细菌或细胞催化产生1μmol丙酮酸的量为一个GOT活力单位。
GOT(U/104 cell)=x×(V样本+V试剂一)÷(500÷V样总×V样本)÷T=0.024x
V样本:吸取样本体积,0.005mL;V试剂一:吸取试剂一体积,0.025mL;V样总:吸取提取液体积,1mL;W: 样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;T:反应时间,0.5h;500:细胞数量,500万个。
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