货号:UPLC-MS-4449 | 规格:100T/48S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4448 | 规格:50T/24S |
可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 30 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 10 mL×1 瓶 |
-20℃保存 |
试剂二 |
液体 10 mL×1 瓶 |
-20℃保存 |
试剂三 |
粉剂×2 瓶 |
-20℃保存 |
试剂四 |
液体 15 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制:
试剂三:临用前每瓶加入 5mL 蒸馏水充分溶解备用,用不完的试剂仍-20℃分装保存。
GS(EC 6.3.1.2)主要存在于植物中,是生物体内氨同化的关键酶之一,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺, 不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性,而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。
GS 在ATP和Mg2+存在下,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺进一步转化为γ-谷氨酰基异羟肟酸, 在酸性条件下与铁形成红色的络合物;该络合物在540nm处有最大吸收峰。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
血清(浆)样本:直接检测。
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。
2、 在EP管中加入下列试剂:
试剂名称(μL) |
测定管 |
对照管 |
试剂一 |
320 |
|
试剂二 |
|
320 |
试剂三 |
140 |
140 |
样本 |
140 |
140 |
混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)准确水浴30min |
||
试剂四 |
200 |
200 |
混匀,静置 10min 后,5000g,常温离心 10min,取上清液测定 540nm 处的吸光值 A。ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。
单位定义:每mL血清(浆)在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
GS(U/mL)=ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T =19×ΔA
2. 组织、细菌或细胞GS活性
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
GS(U/mg prot)=ΔA×V反总÷(Cpr×V样)÷0.01÷T =19×ΔA÷Cpr
(2) 按样本质量计算:
单位的定义:每g组织在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
GS(U/g 质量)=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.01÷T =19×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞数量计算:
单位定义:每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
GS(U/104 cell)=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T =0.038×ΔA
V反总:反应体系总体积,0.8mL;V样:加入样本体积,0.14mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,30min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
试剂一、试剂二可能会有析出,可以重悬后使用,反应后取上清测定。
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